The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project &#8220;M&#228;rkte von &#220;bermorgen&#8221; (SkinHeal).

주 : 프로토콜 24 전층 피부 등가물의 제조를 위해 설계된다. 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포 인간 21, 22 동의서 사전 얻었다. 이전에 출판 된 프로토콜에 따라 피부 생검에서 분리하고, 연구는 율리우스 막시밀리안 대학 뷔르츠부르크의 인간 연구에 대한 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다 (182 투표 / 10). 피부 구성 요소 1. 생산 <ol><li> 6 mg / ml의 최종 농도로 0.1 % 아세트산과 콜라겐 녹인다. 겔 중화 용액의 경우, 232.5 ml의 DMEM 배, 7.5 ml의 소 태아 혈청, 7.5 ㎖의 3 M HEPES, 2.5 ml의 콘드로이틴 설페이트 (5 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. 얼음 젤 중화 솔루션과 콜라겐 솔루션을 유지합니다. 삽입 / 피부 당량 당 겔의 500 μl를 계산합니다. 주 : 겔 중화 용액 콜라겐 용액 처리장의 두 부분과 혼합 될 수있는 바와 같이콜라겐의 양을 두 번 다시. </li><li> 24 웰 플레이트에 24 삽입을 놓습니다. </li><li> 10 ml의 DMEM, 270 XG에 5 분 동안 원심 분리기에 인간의 피부 섬유 아세포 (HDF)를 재현 탁하고 세포를 계산합니다. g X 270에서 5 분 동안 필요한 HDF의 양 (500 μL 콜라겐 젤 당 5 × 10 4 세포)와 원심 분리기 세포를 추출합니다. </li><li> 4 ml의 기포를 생성하지 않고 겔 중화 용액 냉각에 재현 탁 HDF를 조심스럽게 상층 액을 제거하고. 이 단계에서 콜라겐 젤의 조기 응고를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 작업을해야합니다. </li><li> 콜라겐 용액 8ml를 가진 용액을 재현 탁. </li><li> 다단계 피펫으로 콜라겐 세포 혼합물을 가지고 각 삽입 빠르게 혼합물의 500 μl를 입력합니다. 인큐베이터에서 20 분 동안 젤을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2) 젤 굳어진합니다. </li><li> 웰당 2ml의 둘 베코 변형 이글 DMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)에서 겔을 담근다및 인큐베이터에서 24 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)를 위해 그것을 품어. </li></ol> 인간의 표피 각질 형성 세포의 2. 추가 (HEK) <ol><li> 24 시간 후 배지를 제거합니다. 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 초순수 인간 피브로넥틴 단백질을 녹인다. 피브로넥틴 용액 25 μL에 해당하는 각각의 피부를 커버. 배양기에서 30 분 동안 젤을 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2). </li><li> 한편, 10 ㎖ KGM-2를 재현 탁 및 HEK KGM-2 + 5 %의 FCS 준비로 1 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 설정한다. 각 겔에 씨앗 1 × 10 5 HEK. 인큐베이터에서 45 분 (37 ° C, 5 % CO 2) 세포가 준수 할 수 있도록 젤을 품어. </li><li> 인큐베이터에서 KGM-2 + 준비 5 % FCS와 문화를 (37 ° C, 5 % CO 2)와 젤을 담그지. </li></ol> 전체 두께 피부 등가물 3. 문화 (FTSE) <ol><li> 6~7일에 대한 문화 FTSEFCS 농도 (5 %, 2 %, 0 % FCS)을 내림차순. 다음으로 낮은 FCS 농도가 2-3 일마다 매체를 변경합니다. 이를 위해, 완전히 매체를 제거하고 신선한 매체의 1.6 ml를 추가합니다. </li><li> 7 일에서 완전히 매체를 제거합니다. 참고 : 그렇게하는 동안 피펫의 끝 FTSE 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 모든 멸균 집게로 6 웰 플레이트의 한 우물에 삽입 놓습니다. FTSE 표면을 젖은 가지 않도록 잘 당 1.5 ml의 공수 매체를 추가합니다. 추가로 14 일 동안 2-3 일마다 중간 변경합니다. 주 : 배지의 충전 레벨은 FTSE의 메 니스 커스에 달려있다. </li></ol> 4. 조직 학적 분석 <ol><li> 고정 및 FTSE의 파라핀 삽입 <ol><li> 실온에서 2 시간 동안 조직을 신선한 24 웰 플레이트에 삽입을 전송하고 잘 1.6 ml의 각 % 파라 포름 알데히드 (4)를 추가하여 조직을 수정하고 배양, 배양 배지를 제거합니다. 주의! Paraformaldehyd이 독성, 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. 이전조직 포함 카세트 FTSE. 물로 세척하여 남아있는 고정 제를 제거하고 상행 에탄올 농도를 사용하여 조직을 탈수. </li><li> 중간에 수직 절단에 의한 피부 등가를 나눈다. 아래쪽 절단면과 파라핀 채워진 금속베이스 몰드의 두 조각을 놓는다. 백업으로 금형의 상단에있는 조직 카세트를 추가합니다. </li><li> 적합한 현미경 슬라이드에 슬라이드를 장착, 3-5 μm의 조각을 잘라 straitening에 대한 40 ° C의 물을 욕조에 그들을 떠. 완전히 건조 조각. </li></ol></li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)과 면역 조직 화학 (IHC) 염색 <ol><li> 장소는 랙에 슬라이드와 60 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 파라핀이 용융되어 있는지 확인합니다. 얼룩은 표준화 개요 염색으로 H &amp; E와 조각을 재수. </li><li> H &amp; E 염색을 위해 에탄올 50 %, 4 배 탈 이온수, 1 배 헤 마톡 실린, 1X 염산-E 1X와 에탄올로 2 배, 에탄올로 3 배, 크 실롤으로 70 %를 96 %를 4 배 유리 염색 큐벳을 준비thanol (13.7 ml의 1 M 염산 광고 200 ml의 50 % 에탄올), 1X 탭 물, 1X 에오신 및 배 2- 프로판올 (100 ㎖ 탈 이온수에 1g의 에오신). </li><li> 장소는 크 실롤의 I에서 10 분 deparaffinize과 슬라이드를 재수하는 크 실롤 II에서 10 분을 슬라이드. 딥 에탄올 50 % 에탄올 70 %와 3 배에서 3 배, 에탄올에 에탄올 96 % I, 배에 96 % II를 3 배를 슬라이드. 탈 이온수에서 슬라이드를 돌립니다. 헤 마톡 실린 염색, 염산 - 에탄올 딥 배를 구분합니다. 탈 물에 씻어. 청소법를 들어, 장소는 수돗물에 5 분을 슬라이드. 에오신 염색의 경우, 장소는 에오신에서 1 분 슬라이드 탈 이온수에 나중에 씻으십시오. 탈수 법, 딥 슬라이드 에탄올 96 % 에탄올에 70 %, 2 × 2 배 및 2- 프로판올 II에서 5 분 동안 2- 프로판올 I에서 5 분 동안 놓으 크 실롤에서 5 분 I 및 크 실롤 II에서 5 분. H &amp; E 염색 한 후, 세포 핵은 빨간색으로 염색 블루, 세포질과 세포 외 기질에 염색. </li><li> 항원 검색을 위해, 자일 렌으로 파라핀을 제거하고 염색에 대한 슬라이스 재수. 장소 조각증기 밥솥에 미리 가열 된 10 mM에서 20 분 구연산 완충액 (pH 6)에 대한 탈 파라핀과 재수 조각을 요리하고. </li><li> 액체 구충제 슬라이드 마커 펜 또는 다이아몬드 스타일러스 세척 버퍼에 넣어 슬라이드 (PBS 버퍼 + 0.5 % Polysorbat 20)과 원 조각. </li><li> 수분 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이스에 100 ㎕의 3 % 과산화수소 용액을 첨가하여, 내인성 퍼 옥시 다제를 차단. 주의! 피부와 눈에 접촉 한 경우, 대단히 유해 함. 개인 보호 장비를 처리합니다. 워시는 세탁 버퍼에 슬라이드. </li><li> 차 항체를 적용하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 세척은 세척 버퍼로 3 회 슬라이드. 여기부터, 샘플은 어둠 속에서 유지되어야한다. </li><li> 결합 특이 항원 - 항체의 검출을 위해 비오틴 - 스트렙 타비 딘 탐지 시스템을 사용합니다. </li><li> 1 분 동안 헤 마톡 실린 핵을 Counterstain과. 탈수 및 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 역 현미경을 사용하여 이미지 샘플. </li></ol></li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 자동 상처 장치의 사용에 의한 상해 (AWD) <ol><li> 70 % 에탄올 및 자외선과 작업 영역을 소독하여 AWD를 준비한다. 원하는 크기의 드릴 헤드를 확인합니다 (예를 들어, 1mm)가 부착되어있다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 멸균 샘플 캐리어 플레이트의 지정된 영역으로 피부 등가물을 놓습니다. 드릴링 헤드 아래의 소켓에 샘플 캐리어 플레이트를 놓습니다. </li><li> 스핀 속도 : 다음과 같이 상처 매개 변수를 설정하는 제어 소프트웨어를 사용하여 15,000 RPM을; 침투 : 1.5 mm; 추진 : 100 Hz에서. 이들 파라미터는 개별적으로 각각의 샘플 유형에 대해 정의 될 필요가있다. 전송 AWD에 매개 변수 부상을 입었습니다. </li><li> 절차를 상처 시작합니다. 소켓에서 샘플 캐리어 플레이트를 제거합니다. 전송 멸균 집게를 사용하여 배양에 사용되는 인서트로 다시 FTSE 부상. </li><li> 중생의 조사를 위해 인큐베이터에 상처 FTSE의 문화 (37 ° C, 5 % CO 2)를 진행합니다. 알대체적으로, 언제든지 조직 학적 분석을위한 모델을 사용합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

시험 관내 세포에서 세포가 보통 플라스틱 표면에 부착하는 이차원 세포 배양 물에서 확장된다. 그러나 이러한 배양 조건은 세포가 생체 내에서 성장하는 생리 학적 입체 조건을 반영하지 않습니다. 입체 조건에서 세포는 자연 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 첨부 파일을 형성 할 수 및 3 차원으로 이동한다. 세포 이동 및 행렬 생성은 상처 치유의 핵심 요소로서, 특히 생체 내 ...

피부는 신체에서 가장 큰 기관이다. 그것은 외부 환경과 내부 장기 사이에 장벽을 만듭니다. 또한, 피부는 유체 손실, 환경 적 영향, 상처 감염으로부터 몸을 보호하고, 체온을 조절 한 것을 돕는다. 인해 노출 된 위치에, 피부는 종종, 기계적, 열적 또는 화학적 외상에 의해 영향을 받는다. 피부 자체 수리의 일반적으로 사용하는 것은 아니지만, 감염, 산소, 정맥 자족 여러 지역 요인 손상된 상처 치유 될 수 있습니다. 상처 치유는 비만, 알코올 중독, 흡연, 약물, 영양, 당뇨병과 같은 질환 등의 전신적인 요인에 의해 방해 할 수있다. (2) (I) 염증 상, (II) 및 증식 (III) 리모델링 단계 : 상처 치유 과정은 3 단계로 나눌 수있다. 피부에 손상되면, 복잡한 신호 캐스케이드 상처의 폐쇄로 이어지는 시작합니다. 3손상 후 상처 출혈과 혈병이 형성된다. 섬유 아 세포는 혈액 응고로 이동하고 이후 년 동안 리모델링되어 새로운 조직으로 대체. 생물학적 과정의 기본 피부 복구 전류 이해는 제한된다. 작은 동물과 돼지 모델은 상처 치유를 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 이러한 결과는 직접 종 특이 차이에 의해 인체에 전달 될 수 없다. 이러한 생체 내 모델에 추가하여, 상처 치료의 일부 양태들은 4 선택된 긁 모델 고도로 표준화. 불멸화 세포주 또는 일차 세포에 기초한 생체 외 단층 배양 스크래칭을 통해 상처 상황을 시뮬레이션에 의해 연구 할 수 있지만, 충분히 반영되지 않는다 복잡한 생체 내 생리. 5 이차원 모델은 또한, 삼차원 인간 피부 등가물 피부병 연구 개발되어왔다. 이 모델의 피부 부분은 GE 있습니다nerated 탈세 포화 진피 6 콜라겐 히드로 겔, 7,8 글리코 9 또는 합성 재료 등 다양한 지지체를 사용. (10)이 피부 등가물을 채용, 상피 간엽 상호 작용 (11)의 역할을, 재 상피화, 섬유 아세포 및 각질 세포 및 간 세포 누화 다른 성장 인자의 영향이 연구 될 수있다. 또한,이 모델은 섬유 아세포가 부상 영역으로 마이그레이션하는 방법과 화학 주성 인자가 조직 재생에 영향을 미치는 방법에 대한 새로운 지식을 습득하는데 유용하다. (12) 상처 치유 모델 자체의 생성뿐만 아니라 도전이지만, 또한 모델의 고도로 표준화 상처 문제가 확립. 일반적인 기술은 상처 스크래치 테스트, 13 화상, 14 테이프 마모, 15 열 손상, 16 흡입 물집, 17 액체 질소, 18 레이저, 19 있습니다 만들 수 있습니다 </SUP&gt; 메스, 18 메쉬 작업자 6 생검 펀치. 이러한 방법 20 대부분 같은 함정이있다. 수동으로 구현 부상 표준화 및 여러 테스트를 사이에 재생하기 어렵습니다. 크기, 형상 및 상처의 깊이 연구 사이에서 변화하고, 따라서 연구 데이터의 품질이 저하. 정의 피부 상처 용 레이저의 사용은 비교적 용이하지만 표준화 화상 상처를 흉내 낸 상황에 이르게 할 수있다. 레이저에 의해 적용 열 괴사 조직으로 이어질 수 있습니다 단백질 변성, 혈소판 응집 또는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다. 대안적인 접근법에서, 우리는 우리가 멸균 조건 하에서 정확한 정의 및 피부 상처를 생성 할 수있는 자동화 된 상처 소자 (AWD)를 개발 하였다. 깊이 및 속도의 침투뿐만 아니라 드릴 헤드의 회전 수 등을 파라미터 상흔을 규제 할 수있다. 이 연구에서 우리는 집에서 개발 한 전체 두께 피부 등가물과 AWD를 결합 (피트Gangatirkar 등에 의해 발표 된 프로토콜에 비교할 SE). (8) 피부 상당의 피부 층은 내가 하이드로 콜라겐에 포함 된 인간 피부 섬유 아세포 (HDF)로 구성되어있다. 진피층에서 인간의 표피 각질 형성 세포 (HEK)은 시드입니다. 공기 - 액체 계면에서 2 주 이내에 HEK 여러 중요한 세포층과 각질층 이루어지는 표피를 구축. 이 모델의 생성 외에도,이 연구는 FTSE에 정의 된 정확한 상처를 만들 수있는 AWD를 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid)</td><td>Produced in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human Protein, Plasma (50&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>Nunc</td><td>140627</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Nunc</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Fibroblasts culturing (500 ml):&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Bio &amp;amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>10% (50 ml)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Keratinozyten culture medium (500 ml):&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td>Promocell&amp;nbsp;</td><td>C-20111</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td><td>Promocell&amp;nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Gel neutralization solution (250 ml):&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td>93% (232.5 ml)</td></tr><tr><td>Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage</td><td>Sigma</td><td>C4384-1g</td><td>1% (2.5 ml)</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Bio &amp;amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>3% (7.5 ml)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H3375-1kg</td><td>3% (7.5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Skin model submers medium (500&amp;nbsp;ml):&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td>Promocell&amp;nbsp;</td><td>C-20111</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td><td>Promocell&amp;nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Bio &amp;amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>5%-2% (25 ml-10 ml)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Skin model air-liquid interface medium (500 ml):&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack</td><td>Promocell&amp;nbsp;</td><td>C-39011</td><td>adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (300 mM)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C7902-500g</td><td>0.62% (3.1 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Histology:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>CK14 antibody</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>HPA023040-100&amp;micro;l</td><td></td></tr><tr><td>CK10 antibody</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab81468</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;H&amp;amp;E staining:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mayer&amp;acute;s Haemalaun</td><td>AppliChem</td><td>A0884,2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296325-4X2L</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-4X2.5L</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1289-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

고립 된 HDF와 HEK는 형태와 일반적인 마커의 발현 모두 다르다. HEK의 형태가 볼일 형태에 의해 설명 될 수있는 반면 HDF는 전형적인 스핀들 형상의 형태를 보였다. 세포 FTSE 위해 사용하기 전에 면역 조직 화학 염색 (도 1)을 특징으로 하였다. HDF는 멘틴 (그림 1A), 섬유 아 세포 마커에 대한 긍정적이다. 차 HEK 매우 초기 분화 단백질 아세포-14 (그림 1B)하지만 거의?...

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Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K 조회수.  University Hospital Würzburg. The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility. 

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

연구

발생학

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

생체공학

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

양적, 피부가 상처 관리를위한 등각 피부와 같은 전자 시스템의 제조 및 특성

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>유연한 연구 응용을 위한 효율적인 3D 피부 모델

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 비용 효율적인 3D 세포 모델을 통한 피부 모델 다양성 향상

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

요약

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약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기

양적, 피부가 상처 관리를위한 등각 피부와 같은 전자 시스템의 제조 및 특성

개선 2D 및 3D 스킨

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축