Name: mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
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The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

1. 샘플 준비 및 동결 건조 <ol><li> 0.22 ㎛의 멸균 필터를 이용하여 적당한 완충액 및 필터에 대해 메가 스톡 용액의 필요한 양을 투석. </li><li> (; pLeu L-2- 아미노 -4,4- 아지 - 펜 탄산) 적당한 완충액 원액 부형제 및 사진 류신의 필요한 양을 준비한다. 0.22 μm의 살균 필터를 통해 주식 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 단백질, 부형제, pLeu 및 버퍼의 저장 용액을 사용하여 표 1에 나타낸 바와 같이 제형을 준비한다. </li><li> 0.22 μm의 살균 필터를 통해 필터 샘플 단계 1.3에 형성하는 입자를 제거합니다. 2 ㎖의 유리 병에 0.2 ㎖를 별도로 샘플을 채 웁니다. SSPL-MS 연구에서 pLeu을 활성화하기 위해 UV (365 nm의) 빛에 투명 유리 병을 사용합니다. </li><li> 동결 건조기에서로드 튜브 및 적절한 동결 건조 사이클을 설계하여 동결 건조를 시작합니다. <ol><li> 여기서, -40 ° C에서 샘플을 동결 다음12 시간 동안 25 ° C에서 12 시간 및 보조 건조 -35 ℃에서 진공 (70 mTorr 이하)에서 차 건조로. 동결 건조 사이클 및 다른 건조 방법 (예를 들면, 분무 건조)도 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 캐핑 전에 질소로 동결 건조 된 샘플을 함유하는 튜브 백필. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 공식 </td><td colspan="5"> 조성물 (㎎ / ㎖)의 동결 건조에 앞서 </td></tr><tr><td> 메가 </td><td> 트레 할로 오스 </td><td> 소르비톨 </td><td> pLeu의 C </td><td> 칼륨, 인산염, pH가 7.4 </td></tr><tr><td> MBT의 </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MBS의 </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MBT + pLeu의 B </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14.3 × 10 -3 1.43 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MBS는 + pLeu의 B </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14.3 × 10 -3 1.43 </td><td> 0.4 </td></tr></tbody></table> 표 1 :... 동결 건조 메가 제제의 구성 ssHDX-MS 연구에 사용되는 제제 SSPL-MS 연구에 사용되는 B 제형의 C L-2- 아미노 -4,4- azipentanoic 산 또는 사진 류신 (pLeu). pLeu은 1 배에 해당하는 다섯 가지 농도 (14.3 × 10 -3 1.43에 ㎎ / ㎖)에서, MB의 10 배, 20 배, 50 배 및 100 배 몰 과량은 MBT 및 MBS 제제와 공동으로 동결 건조 하였다. 본래 단백질 2. ssHDX-MS <ol><li> K 2 CO D 2 O previousl의 3-200 ml의 포화 양 (~ 440g)를 추가합니다Y는 건조기의 하부 구획에 위치. 밀폐 건조기를 밀봉하고 43 %에 도달 ~의 안정적인 상대 습도 (RH)까지 5 ° C에서 평형 수 있습니다. 그 밖의 관심 RH 값은 다른 포화 염 용액 (23, 24)를 선택함으로써 얻어 질 수있다. </li><li> 건조기의 상부 구획에서 동결 건조 된 단백질을 함유하는 바이알을 캡핑 배치하여 ssHDX 반응을 시작합니다. 데시 케이 터 빵빵한 인감 및 HDX는 (그림 2A)를 발생할 수 있도록하기 위해 5 ° C에서 품어. </li><li> 세중 여러 번 ssHDX 샘플을 수집합니다. 메가 도료 용, 아홉 시점 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 및 144 시간에서의 샘플을 수집한다. </li><li> 즉시 데시 케이 터에서 철수 한 후 튜브를 씌우고 액체 질소의 병을 동결 플래시로 반응을 끄다. 질량 분석 할 때까지 -80 ° C에서 보관 유리 병. </li><li> 적합한 고분해능 액체 크로마토 그래피 - 질량 spectrom를 사용하여 샘​​플을 분석etry (LC-MS) 방법. 디자인 또는 샘플 분석하는 동안 다시 교환을 최소화하기 위해 적절한 냉장 LC 시스템을 구입할 수 있습니다. 열 냉각 유닛의 설정을 사용하여 LC-MS 방법 (25)은 이전에보고 하였다. 주 : 아미드 양성자 교환 율은 pH 및 온도에 의존하기 때문에, 단백질에 혼입 deuterons는 이동상의 존재하는 수소 ( &quot;뒤 교환 &#39;)와 교환하는 정보의 손실을 야기 할 수있다. 급랭 버퍼 및 HPLC 용매의 산성 pH (PH 2.5)의 온도를 감소 큰 정도 백 교환을 최소화 할 수 있지만 (≤0 ℃) 상기 백 - 교환로부터 단백질을 보호 할 수있는 적합한 열 냉각 시스템으로 . </li><li> 자동으로 탈염 및 용출 과정을 제어하는​​ 밸브 샘플 루프와 단백질 트랩을 연결합니다. 200-3,200의 m / z 범위에서 질량 분석기로 TOF 저농도 튜닝 믹스를 주입하여 질량 분광계를 보정. 고정펩신 컬럼 및 분석 열은 그대로 단백질 분석을 위해 필요하지 않습니다. </li><li> ° C를 ≤0 및 ~ 0 ° C의 안정된 동작 온도에 도달하는 방식을 기다릴 냉장 시스템의 온도를 설정. </li><li> 신속 질량 분석을 위해 액체 질소로 -80 ° C에서 샘플들을 전송할. 집게를 사용하여 조심스럽게 액체 질소의 각 바이알을 인출하고 바이알을 물에 0.2 % 포름산 (FA) (PH 2.5), 5 % 메탄올을 함유하는 빙냉 급랭 버퍼의 체적을 첨가하여 샘플을 재구성한다. </li><li> 적당한 HPLC 및 제어 소프트웨어를 사용하여 질량 분석 방법을 프로그램. 메가 도료 용, 구배를 사용하여 5 % 아세토 니트릴, 95 % 물 및 0.1 % 포름산 (FA) 및 용출 1.7 분 동안 단백질 트랩에 20 pmol의 메가 함유 탈염 샘플은 80 % 아세토 니트릴, 20 % 물 및 0.1로 증가 3.3 분에서 % FA. m / Z 범위 200-3,200을 통해 질량 스펙트럼을 수집합니다. </li><li> 본래의 질량을 결정하기 위해단백질, 단계 2.9의 방법을 사용하여 수용액 undeuterated 단백질 샘플 (되지 ssHDX 실시 예, 단백질)에 대한 데이터를 획득. </li><li> 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 스펙트럼을 deconvoluting에 의해 undeuterated 및 중수 소화 된 시료의 질량을 얻습니다. 여기서, 15,000-18,000 다, 다에 1.0 질량 해상도, MB의 전 질량을 계산하기위한 90 % 피크 높이 질량 범위를 설정한다. </li><li> 각각의 과거 시점에서 중수 소화 단백질의 질량으로부터 undeuterated 단백질의 질량을 뺌으로써 본래 단백질 (여기서, MB)에 통합 deuterons의 수를 계산한다. </li><li> 다음 방정식을 사용하여 이론적 최대 퍼센트 중수소 흡수 상대적인 계산 (식 1) <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> 교환 아미드 = 아미노산의 총 수의 경우 총 - 프롤린 잔기의 수 - N- 2 ( &quot;2&quot;계정백 신속한 교환을 거쳐 말단 아미노기 및 아미드 수소). </li><li> 적당한 지수 방정식을 사용하여 ssHDX 운동 데이터를 맞 춥니 다. biexponential 식 (수학 식 2) 보통 ssHDX 데이터에 알맞은 착용감을 제공하는 간단. 본 연구에서는 MBT와 MBS를 들어, &quot;빠른&quot;와 &quot;느린&quot;풀을 교환 할 deuterons를 할당하는 biexponential 모델에 데이터를 맞습니다. <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> 여기서 N 빠르고 느린 N에서 교환 아미드의 수는 &quot;빠른&quot;각각 풀 교환 &quot;느린&quot;빠르고 느린 K와 K는 두 풀에 관한 제 1 차 반응 속도 상수이다. </li></ol> 펩타이드 수준에서 단백질 3. ssHDX-MS <ol><li> 단계 2.6에서 다음과 같이 수정하여, 단계 2.8 2.1에 따라 ssHDX을 수행합니다. 고정 된 펩신 (COL)를 연결합니다밸브 UMN 및 분석 열은 이전에 25을보고 펩타이드 트랩과 밸브에 연결된 단백질 트랩을 교체로. 100 내지 1700 범위의 비율을 충전 질량을 설정 질량 분광계를 보정. 주 : 재구성 단계 (단계 2.8) 중에 환원제 및 변성제가 이황화 결합 (예를 들어, 모노클로 날 항체)와 함께 단백질의 펩신 소화를 촉진하기 급랭 완충액에 포함될 수있다. </li><li> 적절한 HPLC 및 제어 소프트웨어를 사용하여 질량 분석 방법을 프로그램. 메가 제제를 들어, 펩타이드 트랩 1.7 10 % 아세토 니트릴을 가진 분, 90 %의 물과 0.1 % FA 0.1 % FA, 트랩 및 탈염 펩티드 온라인 20 pmol의 메가를 포함하는 샘플을 소화. 4.0 분의 60 % 아세토 니트릴 구배로 증가, 40 % 물 및 0.1 %와 FA 분석 컬럼에 용출 단편. m / z 범위에 걸쳐 100-1,700 질량 스펙트럼을 획득. </li><li> 의 MS / MS 분석에 의해 소화성 조각을 식별undeuterated 단백질 샘플. 커스텀 데이터베이스의 펩티드 단편의 예측 대중 펩티드 단편 이온의 질량을 비교 실험하는 질량 분석 소프트웨어를 사용한다. 낮은 오류로 대중을 식별하기 위해 대중에게 컷 - 오프 포인트 (예 : 10 PPM)를 설정합니다. 유사한 펩티드를 들어 (ⅰ) 단백질 서열, (ⅱ) 충전 상태, 및 (iii) 체류 시간으로 구성된 목록을 준비한다. </li><li> 조각을 소화 각 펩신에 대한 통합 deuterons의 평균 수를지도하고 결정하는 단계 3.3에서 생성 된 목록을 사용합니다. 이는 적합한 HDX-MS 데이터 분석 소프트웨어 (24)를 채용함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 퍼센트 중수소 흡수를 계산하고 소화성 단편마다 ssHDX 속도 데이타에 맞도록, 단계 2.13 및 2.14을 따른다. MBT 및 MBS 제제가 biexponential 협회 모델 (식 2)에 설치되었다에서 본 연구에서는 여섯 비 중복 펩신의 각 HDX 운동 데이터 조각을 소화. </li></ol> 본래 프로 4. SSPL-MSTEIN <ol><li> UV 가교 결합제에 광분해 라벨 반응, 첫 번째 스위치를 시작하고 램프가 5 분 동안 워밍업 할 수 있도록합니다. UV 소스가 pLeu의 diazirine 그룹을 활성화하기 위해 파장 365 나노 미터의 램프가 장착되어 있는지 확인합니다. 주의 : 램프가 켜져있을 때 UV 가교제의 문을 열지 마십시오. 소스가 UV 보호 유리 문으로 둘러싸인되지 않은 경우 자외선에 노출 눈과 피부를 보호합니다. </li><li> 문을 열기 전에 UV 가교 결합제을 끕니다. 램프가 턴 오프되면, 동결 건조 제제를 함유하는 바이알 뚜껑을 벗기다 및도 2b에 나타낸 바와 같이 UV 가교제 챔버 내부에 배치합니다. 40 분 동안 UV 광을 시료에 조사. </li><li> pLeu 및 (ii) pLeu와 동결 건조 시료의 재구성 물없이 동결 건조 (I) 샘플 4.3 단계 4.1에 따라 제어 실험을 수행합니다. </li><li> 캡 질량 분석까지 -20 ℃에서 저장하고 바이알. </li><li> Reconstit2 μM까지 농도를 가지고 질량 분석 등급 증류수 적합한 부피를 첨가하여 고체 시료를 UTE. </li><li> 시료 분석을 시작하려면, 단계 2.6 및 2.9을 따릅니다. 주 : 백 교환 공유 라벨링 문제가 아니기 때문에, SSPL-MS는 특별한 냉동 LC 시스템을 필요로하지 않는다. </li><li> 단백질의 기본 질량을 결정하기 위해, 단계 2.9에 따라 SSPL 실시되지 않은 단백질 샘플에 대한 데이터를 획득. 단계 2.11에 설명 된대로 원시 스펙트럼을 deconvoluting에 의해 레이블과 레이블 샘플의 질량을 얻습니다. </li><li> 다음 식을 사용하여 혼입 된 pLeu의 수를 계산한다 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> M의 L 개 단백질의 질량이고, M은 N 천연 단백질의 질량이고, 115 (다)는 단일 pLeu 혼입 다음 천연 단백질에 첨가 질량 평균이다. 라벨 반응이 일 발생합니다N이 E의 손실 (28 다). pLeu의 모노 이소 ​​질량은 143.07이다. </li><li> 추출 된 이온 크로마토 그램에서 피크의 높이를 사용하여 라벨의 다른 숫자 단백질 인구의 비율을 계산합니다. <img alt="수학 식 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> &quot;I&quot;는 라벨의 개수를 나타내고, PH 나 질량 분석법에 의해 관찰 표지 단백질 L I 및 PH 대한 피크 높이 U는 표지 된 단백질의 피크 높이를 나타내고 나타낸다. </li></ol> 펩타이드 수준에서 단백질 5. SSPL-MS <ol><li> 단계 4.4 4.1에 따라 SSPL을 수행합니다. </li><li> 펩티드 수준의 분석을 위해, 중탄산 암모늄 완충액 (100 ㎜, 8.0의 pH)에서 고체 샘플들을 재구성. </li><li> 재구성 한 후, 10시 트립신 표지 단백질 용액을 혼합 : 트립신에 단백질 1 몰비로 16 시간 동안 60 ℃에서 배양한다. </li><li> FA 0.1 %를 첨가하여 반응을 켄 칭하고시료를 물에 2 μM 최종 단백질 농도를 얻었다. </li><li> HPLC 시스템에 연결된 밸브 샘플 루프, 펩타이드 트랩 및 분석 컬럼을 연결합니다. </li><li> 적당한 HPLC 및 제어 소프트웨어를 사용하여 질량 분석 방법을 프로그램. 메가 도료 용, 구배 분석 컬럼에서 용출 한 후, 5 % 아세토 니트릴, 95 % 물 및 0.1 % FA로 1.5 분 동안 펩티드 트랩 펩티드 시료 루프로 분해 단백질의 20 pmol의 주입 및 탈염 22 분 55 % 아세토 니트릴, 45 % 물 및 0.1 %로 증가 FA. m / Z 범위 100-1,700을 통해 질량 스펙트럼을 수집합니다. </li><li> 이러한 이전 그대로 단백질 분석에서 계산 pLeu의 숫자 ExPASy (26) 온라인 도구를 사용하여 부가 펩타이드 pLeu에 대한 이론적 질량 목록을 준비하십시오. 최소 4가 분열을 놓친 포함합니다. 라벨 반응은 N 2의 손실이 발생합니다. 비 표지 된 try 따라서 펩타이드 pLeu 부가 물의 질량 = 질량PTIC 펩타이드 + N (pLeu의 질량) - N &quot;n은&quot;통합 ​​pLeu의 수 (N 2의 질량). 참고 : 그대로 단백질의 질량 분석은 단백질의 세 가지 표지 인구로 나타났다 경우, 펩타이드 당 세 가지 pLeu 라벨까지 고려한다. 1 (28) = 1115 다 - 1000 다의 질량을 가진 펩타이드를 들어, 1 pLeu 법인과 펩타이드 pLeu 부가의 이론적 질량은 1,000 + 1 (143)이 될 것이다. 유사하게, 펩티드 pLeu의 이론적 질량은 각각 다 등 1230, 1345 다 일 것 등이 pLeu 3 pLeu으로 부가 물. </li><li> 실험적으로 관찰 된 질량으로 5.7 단계에서 생성 된 이론적 질량리스트 일치하도록 질량 분석 소프트웨어를 사용한다. 낮은 오류로 대중을 식별하기 위해 대중에게 컷 - 오프 포인트 (예를 들어, 50 PPM)을 설정합니다. </li><li> 펩타이드가 일치하는 경우, pLeu의 실제 수는 M L과 M N 개의 대중 있습니다 단계 4.8 (식 3), 아래 공식을 사용하여 통합 결정각각 네이티브 펩티드. </li></ol>

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Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8 (1977).</li><li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li><li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li><li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen/Deuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+(ssHDX-MS).">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li><li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying.">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li><li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li><li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders.">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).</li><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H/D+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics:+is+there+a+need+for+a+top-down+approach.">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li><li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis.">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids.">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

몇몇 연구는 동결 건조 된 시료에서 지역 환경이 단백질 분해 5,29,30 영향을 미친다는 것을 제안했다. 그러나, 고체 상태의 단백질 구조와 안정성 사이의 직접적인 관계를 확립하기 때문에 고해상도 분석 방법의 부족으로 적합하지 않았다. 동결 건조 된 분말에 예컨대 HDX PL과 같은 기존의 방법은 고해상도의 솔루션은 애플리케이션 프로토콜과 신중한 데이터 해석의 수정을 요구한다. HDX-MS-MS 및 PL 연속적 고체 상태에서 단백질 입체 형태를 모니터링하도록 채택되었다. 결과는 여기에 제시된 다른 곳 27,28,31-33 고체 환경에서 높은 해상도와 단백질 형태를 모니터링하는 이러한 방법의 능력을 증명하고있다. 데이터 분석에서 중요한 단계는 솔루션 34 ~ 36에 표시 다를하지 않지만, 실험 장치 및 데이터 해석시 중요한 고려 사항은 고체 CHEMI 필요CAL 표시. 라벨 시약의 선택은 크기와 라벨의 메커니즘을 기반으로해야합니다. 중수소 pLeu 작은 크기의 비교적 큰 크기의 측쇄에 라벨링을 제한하는 반면, 펩티드 백본, 쉽게 프로브 할 수있다. 그 라벨 만 매트릭스 백본 및 측쇄 노광에 의존하고 있으므로 ssHDX SSPL 모두, 임의의 아미노산에 대한 선호도를 표시하지 않는다. 효과적으로 고체의 단백질 입체 형태를 프로빙,​​ 라벨링 처리에 영향을주는 외부 요인 심하게 제어되어야한다. 총량 동결 건조 고형물의 표지 제의 공간 분포는 수용액 다르다. ssHDX에서, 고체 매트릭스 D 2 O의 양이 펼쳐지고 단백질의 비율 (또는 부분 전개), 폴딩 및 중수소 교환에 영향을 미칠 수있다. 이는 단백질이 정상적으로 샘플 D의 2 O. 충분한 용적으로 희석시킨 용액 HDX와 그렇지 않은ssHDX 속도에 수화의 효과를주의 깊게 검사는 이상적인 RH 조건의 선택을 알릴 수 있습니다. 흡습 속도를 제어하고 흡습성 부형제 (예 : 슈 크로즈 및 트레 할로 오스)를 함유하는 제형의 분말의 붕괴를 피하기 위해, ssHDX 냉장 조건 하에서 수행 될 수있다 (2-8 ° C). 예상대로 수화 효과에 대한 우리의 이전 연구는 수분 함량의 증가와 함께 환율과 범위를 증가 보였다. 우리의 일, 5 ° C에서 43 %의 중간 RH의 많은 부분에서 적절한 시간 24 제제를 구분하는 이상적인 것으로 입증되었습니다. 고원에 도달 할 때까지 반응은 통상적으로 수행된다. 이 고체에 흡습 및 확산 HDX 레이트를 제어하지 않도록한다. ≤2 ㎖가 예비 동결 부피 작은 고체 샘플 크기의 사용은 또한 D 2 O 증기 수착 초기 교환주기에서 본질적으로 완료 될 수 있도록 돕는다. 비록 ssHDX-MS는 제공고체 상태에서의 단백질의 입체 구조에 대한 정량적 정보, 데이터의 해석은 전적으로 단독 ssHDX 연구에 근거 할 수없는 특정 조건이있다. 그것은 감​​소 중수소 흡수 인해 단백질 구조의 높은 보존 또는 샘플에 존재하는 단백질 응집체의 상당한 양이 될 수있다 (대조군에 비해) 샘플에서 관찰하는 것이 가능하다. 그러한 경우에, ssHDX 데이터 해석은 상보 다른 방법의 결과를 요구한다. 중수 소화 질량 스펙트럼의 피크 폭이 넓어 여러 메가 제제 (27, 28)에 대한 관찰되었다. 이 D 2 O 농도의 샘플에서 부분적으로 펼쳐진 단백질 인구, 공간 이질성의 존재, 또는 공간 그라데이션 등 다양한 요인에 기인 할 수있다. 그러나, 이러한 요인은 ssHDX-MS 구별하고 추가 조사를 필요로하지 않았다. SSPL-MS는 비교적 새로운 같은 다른 방법 지속적인 학습 AB와 비교할 때해당 응용 프로그램 및 제한 사항에서 필요합니다. SSPL에서, 광 가교제는 단백질과 동결 건조된다. 수분의 부족은 고체 매트릭스 내의 컴포넌트의 이동을 제한하고, ssHDX 흡습에 발생할 수있는 구조적 부분 이완 SSPL의 현상이 아니다. 이것은 광 가교제의 바로 근처에 SSPL에 라벨링을 제한한다. 그러나 HDX-MS, 잔류 수준 구조 정보를 제공 할 수있는 표지 된 단백질의 공유 적으로 MS / MS 분석 달리. SSPL 라벨이 공유하고 되돌릴 수 있기 때문에, 다시 교환이 발생하지 않습니다 및 샘플 준비 및 레이블의 손실에 대한 걱정없이 분석 할 수 있습니다. 표지 제의 확산을 용이하게하고, 고체 매트릭스 라벨링 효율성을 개선하기 위해, 증가는 SSPL % RH로 수행 될 수있다. pLeu 흡수 광 반응성은 약제의 농도를 증가시킴으로써 향상시킬 수있다. 원하는 단백질에 pLeu 몰비 변화 될 수있다. 일반적으로 프로에 pLeu의 100 배 몰 초과TEIN 적절한 라벨을 보장합니다. 그러나, 높은 pLeu 농도는 고체 매트릭스 단백질 삼차 구조의 손실이 발생할 수 있습니다. 따라서, 표지와 동력학 제제 조성물 외에도 pLeu 농도의 선택은 또한 단백질이 구조적 무결성을 유지에 기초해야한다. 이 비 선택적 pLeu XH를 레이블로 기, 그것이 가능하다 (X =는 C, N, O 임)와 유사한 라벨 사이트와 부형제는 크게 단백질의 표지 수준에 영향을 미칠 수있다. 단백질 라벨링 pLeu의 가용성에 부형제의 간섭은 아직 특징으로한다. 그것은 diazirine 활성화로부터 생성 잔류 카르 벤이 특정되지 않은 것이 알려져 있지만 한 연구의 Glu가 Asp (36)을 향해 바이어스를보고한다. 이 잔류 물을 특정 상호 작용에 대해 배우고 좋은 반면, 펩티드 - 레벨 정보도 유용하며 고체 상태에서 높은 매트릭스 노출 영역을 차단하는 부형제를 디자인하는데 사용될 수있다. SSPL-MS는 그러나, 상세한 질적 정보를 제공합니다정량적 데이터는 획득 될 필요가 있고 견고한 메트릭 동결 건조 시스템에 걸쳐 다양한 제형의 차이를 분석하기 위해 개발 될 필요가있다. MS / MS 분석과 결합 잔기 특정 라벨의 사용은 상기 아미노산 수준의 해상도를 향상시킬 수있다. 2,3- 부탄과 같은 레이블 시약의 Arg가의 Cys에 대한리스 및 N -alkylmaleimide 파생 상품 N의 -hydroxysuccinimide 유도체 정확하게 동결 건조 분말 분자 상호 작용을지도하는 데 사용할 수있는 레이블을. 그러나 이러한 시약은 pH에 의존하고 반응은 고체 상태에서 광분해 라벨로 잘 조절되지 않을 수 있습니다. 대체 접근법은 영양 요 세포주, 부위 특이 적 변이 또는 측쇄 유도체의 사용과 단백질 서열에 광 가교제를 포함하는 것이다. 우리의 이전 ssHDX-MS와 SSPL-MS 연구는 단백질의 라벨은 부형제의 성격과 양에 따라 달라집니다 것으로 나타났습니다24,27,28,31-33,37,38을 사용했다. 메가는 저 분자량 (32)와 당 - 동결 공동보다 MB의 전 ssHDX-MS가 구아니딘 하이드로 클로라이드 (Gdn.HCl)와 공동 - 동결 중수소 큰 흡수를 나타내었다. Gdn.HCl 자당 33 MB보다 광분해 라벨에서 더 큰 보호를 보였다으로 별도의 SSPL-MS 연구에서, MB의-동결 건조 공동. 또한, MS-ssHDX 정량적 측정은 매우 장기간 저장 (28) 중에 단백질의 안정성과 관련되어있다. 이러한 연구는 단백질의 ssHDX 또는 SSPL은 동결 건조 분말 단백질의 구조 유지의 정도를 반영하는 것이 좋습니다. 우리는 동결 건조 된 분말의 이차 구조의 유지 측면 체인 pLeu와 라벨 및 중수소 교환에서 아미드 수소의 보호를위한 유리한 환경을 제공하고 있다고 생각합니다. 그러나, 이들 방법에서 상세한 정보 내용의 비교는 미래에 수행 될 필요가있다. ssHDX-MS와 SSPL-MS의 유틸리티를 구축 비록제제 선별 도구로 많은 단백질에 적용 할 것을 궁극적으로 필요합니다, 우리의 최근의 연구 결과는 폭 넓은 채택을 지원합니다. 발전,이 방법은 바이오 산업에서 고체 제형 단백질을 특성화 널리 유용 할 것으로 예상된다.

단백질 의약품은 바이오 제약 산업 중 가장 빠르게 증가하는 호르몬 장애, 암과자가 면역 질환 일을 포함하여 이전에 난치성 질환에 대한 유망한 새로운 치료법을 제공합니다. 2012 년 글로벌 biotherapeutics 시장은 138,000,000,000달러에 도달 년까지 1천7백90억달러에 도달 할 것으로 예상되어 2018 2. 단백질은 크고 기존의 작은 분자 약물보다 더 깨지기 쉬운 그래서 저하 (3) 많은 종류에 더 민감하다. (즉, 동결 건조) 고체 분말을 동결 건조로 충분한 저장 수명과 안정성을 보장하기 위해, 단백질 의약품은 종종 공식화된다. 그러나 단백질은 여전히 기본 구조가 동결 건조 공정 4,5- 중에 보존하지 않은 경우 특히 고체 상태에서 열화를 거칠 수있다. 그 구조를 유지 한 내용으로 보장하는 것은 sufficien 고체 형태로 단백질을 검사 할 수 분석 방법이있는 경우에만 가능하다t 해상도. NMR 분광법 (6)와 X 선 결정학 7은 결정질 고체 용액 및 8 단백질 구조를 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 고해상도 방법이다. 이 때문에 사용되는 부형제 및 처리 방법의 특성, 동결 건조 제형 단백질은 대개 비정질이 아닌 결정 구이다. 균질성 및 미세 순서 부족 무정형 고체의 단백질을 상기 언급 된 기술은 실용적이지. 푸리에 변환 적외선 분광기 (FTIR) 열 변형, 라만 분광기 (11) 및 근적외선 분광학 (NIR) (12)가 정기적으로 네이티브 용액 상태 구조의 동결 건조 분말에서 단백질의 이차 구조를 비교하는 바이오 산업에서 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법은 낮은 해상도는 단지 이차 구조 글로벌 변경에 대한 정보를 제공 할 수있다. FTIR을 사용하여 고체 구조 특성장기 저장 안정성 13,14 약한 상관 나쁨 15를 보여 주었다. 이러한 제한은 고해상도 적합한 방법, 고체 단백질 구조적 섭동을 식별 할 필요성을 강조. 단백질 분해 및 질량 분석 화학 결합 라벨링 수용액 단백질 분자 구조와 상호 작용을 모니터링하는 강력한 방법으로 떠오르고있다. 약제 개발, HDX-MS는 단백질 의약품 (19)의 형태에 번역 후 변형의 효과를 모니터링하기 위해, 수용체 - 약물 상호 작용 (18)를 매핑하고, 비교하기 위해 항원 - 항체 상호 작용 (16, 17)의 에피토프 맵핑을 위해 사용되어왔다 밀러 (20)를 개발 뱃치 간 변이. 마찬가지로, 광활성 리간드는 약물 표적을 식별하고 결합 친화력 및 약물 - 수용체 상호 작용의 특이성 (21, 22)을 결정하는데 사용되어왔다. 전자하려면xtend 동결 건조 제제에 이러한 방법의 적용, 우리 그룹이 개발 한 고체 수소 중수소 교환 질량 분석 (ssHDX-MS)와 고체 광분해 라벨 질량 분석법 (SSPL-MS)는 동결 건조 된 시료에서 단백질의 입체과 부형제의 상호 작용을 연구하는 높은 해상도. ssHDX-MS-MS 및 SSPL 모두에서, 동결 건조 된 고체 단백질은 이상적 반응 조건 하에서 표시하고, 재구성 된 샘플은 다음과 함께 또는없이 단백질 분해 소화를 질량 분석법에 의해 분석된다. SSPL-MS는 측쇄의 환경에 대한 정보 (도 1)를 제공하는 동안 ssHDX-MS는 중수소 수증기 주쇄 노출에 대한 정보를 제공한다. 이와 같이 두 가지 방법은 고체 형태의 단백질에 대한 상보적인 정보를 제공 할 수있다. 여기, 우리는 다음과 같이 메가 (그림 2) ssHDX-MS와 SSPL-MS를 사용하여 동결 건조 된 고체 단백질을 연구 사용하는 일반적인 프로토콜을 제공모델 단백질. 우리는 두 가지 상이한 제형 부형제와의 차이를 구별하기 위해 두 가지 방법의 능력을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> 도 1 :. 다른 메커니즘을 통해 라벨링 동결 건조 된 고형물 및 ssHDX SSPL 측정 단백질 구조 (A)에서 HDX는 백본 아미드 단백질 구조 및 기능의 D 2 O 접근성로서 중수소 교환 수소. 고체 상태에서, 속도 및 중수소 교환의 정도는 D 2 O 수착, 단백질 이동 (전개 및 이벤트 폴딩) 및 고체 매트릭스에 존재 부형제 특성의 레벨에 의존한다. pLeu diazirine의 관능기로부터 중간 반응성 카르 벤의 형성을 개시하고 XH 결합 (X는 임의의 원자 =), 또는 광고에 비특이적으로 삽입 nm의 PL에있어서 (B), (365)에 UV 조사그 바로 근처의 C = C 결합을 통해 공격 한. 고체 상태에서, 라벨의 속도 및 정도는 로컬 표지 제의 농도, 조사 시간, 단백질 구조 및 고체 매트릭스에 존재하는 첨가제의 성질에 의존한다. 패널 A와 B는 단백질에 각각 백본 및 사이드 체인에 발생할 수있는 최대 이론 라벨을 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> 도 2 : 도식 보여주는 고체 HDX-MS (A)와 동결 건조 제형 단백질 PL-MS (B).

<table><tbody><tr><td>Equine myoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#240850</td><td></td></tr><tr><td>L-Photo-leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>#22610</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>#DLM-4-PK</td><td>Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Immobilized pepsin</td><td>Applied Biosystems</td><td>#2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used</td></tr><tr><td>Water, Optima LC/MS grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>#7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#34998</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>#G1969-85000</td><td>Highly flammable liquid</td></tr><tr><td>Protein microtrap</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>Peptide microtrap</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>Analytical column</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker equipped with five 365 nm lamps</td><td>Stratagene Corp.</td><td>Stratalinker 2400</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 series LC</td><td>Refrigerated LC system for HDX-MS</td></tr><tr><td>ESI-qTOF MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer (HDX-MS data analysis software)</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders

질량 분석 하였다 아미드 수소 / 중수소 교환 (ssHDX-MS) 및 측쇄 광분해 라벨링 (SSPL-MS)은 단백질 치료제의 동결 건조 제제를 특징 짓는 유용 할 수있다. 적합한 단백질 분해 소화 하였다 라벨링 단백질 구조 및 상호 작용이 펩티드 - 레벨 해상도로 매핑 될 수있다. 단백질 때문에 구조적 요소는 주 사슬 아미노산, 아미노산 잔기에서의 원자의 특정 표지 단백질의 구조 및 형태에 대한 통찰력을 제공의 측쇄에서 화학 결합의 네트워크에 의해 안정화된다. 동결 건조 된 고체 (예를 들어, FTIR), ssHDX-MS와 SSPL-MS 양적 및 사이트 관련 정보를 제공하는 단백질을 연구하는 데 사용 일상적인 방법과는 대조적으로. 중수소와 결합 동역학 매개 변수 범위가 신속하고 천천히 풀 아미드 교환에 관련 될 수있다 (N 빠르고 느린 N)과 직접 ℃로 반영동결 건조 제제에 단백질 접힘 구조의 REE. 안정 광분해 라벨은 다시 교환, ssHDX-MS보다 이점을받지 않습니다. 여기서는 트레할로스 또는 소르비톨를 함유 동결 건조 제제의 모델로서 단백질 미오글로빈 (메가)을 사용하여, ssHDX-MS-MS 및 SSPL 모두에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.

여기에, ssHDX-MS와 SSPL-MS는 동결 건조 메가 형성의 형태와 고체 상호 작용에 대한 부형제의 효과를 연구하는 데 사용되었다. 단백질 및 본 연구에 사용 된 부형제의 농도는 표 1에 나타내었다. 상기 프로토콜이 제시 다음 동결 건조하여 수득 MB의 전 및 ssHDX-MS-MS 분석 SSPL 대표 결과. 본래 단백질 수준에서 흡수 중수소 ssHDX-MS 그대로 수준에서 메가 제제를 구별 할 수 있습니다. 제형에서 MBS ssHDX 144 시간을 그대로 다음 MB의 전 질량 스펙트럼 deconvoluted 제형 MBT (도 3a)보다 큰 중수소 흡수를 보였다. 평균적으로, MBS는 MBT (표 2)에 비해 46 % 더 중수소 흡수를 보였다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; 그림 3 : ssHDX-MS 그대로 메가위한 : 제제에서 중수 소화 그대로 메가의 (A) Deconvoluted 질량 스펙트럼은 MBT (실선)와 MBS (점선) ssHDX 144 시간을 다음과 같습니다. undeuterated 그대로 메가의 deconvoluted 질량 스펙트럼은 (점선) 표시됩니다. (B) 제제에 그대로 메가위한 ssHDX 반응 속도 MBT (실선)와 MBS (점선). ssHDX의 타임 코스 (± SD, N = 3) 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 버전 5를 이용하여 2 상 연관에 대해 지수 방정식에 장착 하였다. 그대로 MBS 및 MBT의 중수 소화 반응 속도는 초기 시점 (1-4 시간)에서 비슷하지만, MBS 시간 (8-144 시간) (그림 3B)의 증가와 중수소 교환을 증가 보였다. 이는 낮은 RH 및 온도 조건에서 ssHDX 위해 긴 시간 포인트를 선택하는 것의 중요성을 시사한다. 또한, D 2 O 수착 및 확산 공정은 초기 시간 ssHDX PO에서의 속도에 영향을 미칠 수있다정수. 우리의 이전 연구에서 ssHDX 흡습이 시간 기간이 완료되며, 이때 넘어 동력학 교환 최소 기여도를 갖는 것으로 나타났다. 관찰 된 속도 및 교환의 범위는 따라서 단순히 D 2 O adsorbtion (27, 28)의 조치를하지 않습니다. 3 개의 독립적 인 ssHDX-MS 샘플에서 표준 편차를 나타내는 그림 3B의 작은 오차 막대는 실험 재현성이 높은 것을 보여준다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 중수소 통풍 관 (%) (B) </td><td> N 빠른 C </td><td> 빠른 C 케이 </td><td> N c 슬로우 </td><td> 느린 C 케이 </td></tr><tr><td> MBT의 </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS의 </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % 변경 D </td><td> 46 % </td><td> 18 % </td><td> 14 % </td><td> 75 % </td><td> 26 % </td></tr></tbody></table> 표 2 :. 메가 제제의 ssHDX 연구에서 중수소 흡수의 정량적 측정 조성은 표 1을 참조하십시오 이론적 최대 B 비율의 중수소 흡수 상대를 그대로 메가하여 HDX 144 시간 후 5 ° C, 43 % RH (N = 3에. , ssHDX-MS 운동 데이터를 비선형 회귀 분석에 의해 결정 평균 ± SD). C 매개 변수. 그대로 메가위한 중수소 교환의 시간 코스는 biexponential 협회 모델 (는 식. 2)에 장착되었다. 괄호 안의 값은. 회귀 매개 변수의 표준 오차입니다 측정의 퍼센트 변화가 calcul했다 거라고ated 100 ×로 [(MBS에서 값 - MBT에서 값) / (MBT에서 값)]. MBT 및 MBS에 대한 중수소 흡수 반응 속도에 대한 회귀 매개 변수 (N 빠르고 N 천천히, 빨리 K와 느린 K) 표 2에 제시되어있다. N 빠르고 N 느린 값은 MBT보다 MBS, N 느린 차이에 대한 큰하지만 N 값은 빠른 값의 차이보다 더 컸다. N 느린 값이 MBT보다 MBS의 75 % 큰 반면 특히, N 빠른 값은 MBT보다 MBS 만 18 % 더 크다. 이 MBT의 작은 N 느린 값으로 인해 MBS에서 D 2 O에 노출되는 부형제로 메가 구조 또는 아미드 그룹의 보호의 높은 유지를 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 자세한 메커니즘은 명확하게 이해되지 않습니다. 두 제제에 대한 속도 상수 (고속 K와 느린 k)는 매우 유사하다. 펩타이드 수준에서 중수소 흡수 펩신 소화 후, 52 펩티드의 총 확인되었다. 메가 서열의 100 %에 해당하는 여섯 비 중복 단편은 여기에보고 분석에 사용 하였다. 이전 24 우리 그룹에 의해보고 등의 추가 정보는 중첩 단편을 사용함으로써 얻어 질 수있다. 각 펩티드 %의 중수소 흡수 계산, 144 시간 샘플의 결과 (그림 4A)를 꾸몄다했다. 여섯 소화성 ​​조각을위한 HDX 속도론은 &quot;느린&quot; &quot;빨리&quot;와 교환을 겪고 아미드 수소의 개체군과 일치 biexponential 행동 (그림 4B)을 보여 주었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> 그림 4 : 펩타이드 수준에서 메가위한 ssHDX-MS : 6 비 redu에 대한 (A) 비율의 중수소 흡수제제에 메가에서 ndant 소화성 조각 (회색) MBT와 MBS (흰색) HDX 144 시간을 다음과 같습니다. 제제의 메가로부터 6 비 중복 소화성 조각에 대한 (B) ssHDX 반응 속도 MBT (실선)와 MBS (점선). ssHDX의 타임 코스 (± SD, N = 3) 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 버전 5를 이용하여 2 상 연관에 대해 지수 방정식에 장착 하였다. 비 중복 펩티드 회귀 파라미터는도 5에 제시되어있다. 펩티드 단편에 대한 장착 속도 상수 개별 아미드에 대한 평균 속도 상수없는 한, 소화성 단편에 대한 관찰 된 속도 상수는 선형 그대로 단백질 것과 관련 될 수 없다. 공법 MBS에서 (단편 56-69 제외) 소화성 조각의 대부분을위한 N 빠른 값은 MBT (그림 5A)에 비해 약간 더 컸다. 유사하게, K 값은 일반적으로 고속 formulatio 거의 차이를 보였다메가 분자 (그림 5B)의 다른 지역과 NS. 그러나 MBS에 대한 N 느리고 K 느린 값은 MBT (그림 5C 및 5D)보다 모든 조각에 상당히 많습니다. MBS 느린 N 느리고 K의 상당한 증가는 &quot;느린&quot;교환 풀에 아미드 그룹의 이동성을 반영 할 수있다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> 그림 5 : 메가 소화성 펩타이드 ssHDX 운동 매개 변수 : N 빠른 (A), MBT (회색) 및 MBS를 (N 느린 (C), 고속 (B)를 K와 제형 메가로부터 6 비 중복 소화성 펩티드 ssHDX-MS 속도 데이타의 비선형 회귀에 의한 느린 (D) 값 케이 화이트) (N = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; 그대로 단백질 수준에서 광분해 표시 LC-MS (도 6a)에 의해 검출 된 MB들은, MB-pLeu 여러 부가 물 20 배 과량 pLeu 형성의 존재를 조사. 20 배 pLeu가 레이블이없는 메가의 질량에 115, 230 및 345 다의 추가로 3 레이블 나타났다로 MBT의 deconvoluted 스펙트럼은 40 분 동안 조사. 20 배와 유사하게 조사 MBS는 pLeu은 LC-MS에 의해 검출 된 최대 2 레이블 인구가 그대로 수준에서 적은 pLeu 흡수를 보여 주었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> 그림 6 : SSPL-MS 그대로 메가 용 : MBT (실선)과 20 배 초과로 표지 MBS (점선)에 대한 (A) Deconvoluted 질량 스펙트럼 pLeu (w 5 % / w). 네이티브 메가 바이트 (MB가 동결 건조한 pLeu의 부재 하에서 조사) Deconvoluted의 질량 스펙트럼을 점선으로 나타낸다. U </EM&gt; 조사 후 레이블이없는 남아 단백질의 인구를 의미한다. 1, 2, 3 pLeu 라벨 운반 단백질 집단은 각각 1L, 2L 3L과 같이 표현된다. 공식에 그대로 메가위한 (B) SSPL-MS 역학 MBT (폐쇄 원)과 pLeu 농도의 함수로 MBS (오픈 원). 모든 샘플을 40 분 동안 조사 하였다. 오차 막대는 기호에 있습니다. (C) 제형에 대한 메가 그대로 SSPL-MS 속도론 MBT (폐쇄 원)와 조사 시간의 함수로서 MBS (오픈 원) (20.7 % w / w)로 동결 건조 및 100X pLeu 과량의 존재를 조사. 오차 막대는 기호에 있습니다. 운동 연구에서, 표지 단백질의 비율이 증가하고 조사 시간 (그림 6B)와 MBT 및 MBS 모두 기하 급수적으로 증가했다. MBS마다 조사 시간에 MBT 미만 pLeu 흡수를 보였다. 두 제형은 40 분에서 고원에 도달 나타났다. 따라서, 운동 연구는 우리가 될 수 있습니다<html> eful pLeu 완전한 활성화를 구하는 데 필요한 조사의 지속 시간을 결정한다. 라벨 반응 속도도 pLeu 농도의 함수 (그림 6C)로 조사 하였다. 표지 단백질의 %는 MBT와 MBS 모두 pLeu 농도가 증가했다. 그러나 pLeu w / w 20.7 %로, MBT는 pLeu 섭취의 감소를 보였다. 이는 높은 pLeu 농도에서 단백질의 표면에서 pLeu의 배제 될 수있다. 따라서, pLeu 다양한 농도와 연구 표면 배제없이 단백질 표면에 걸쳐 충분한 라벨링 가능 pLeu 적절한 농도를 선택하기 위해 수행되어야한다. 본 연구에서는 20 배 초과 pLeu 더 펩타이드 수준의 연구에 선정되었다. 전체는 MBS 관찰 라벨이 pLeu를 포함하는 행렬에 가난한 사이드 체인 접근을 제안 감소했다. 이는 감소 된 라벨링 결과 소르비톨의 존재 형태 변화와 일치한다. 내용 &quot;&gt; 펩타이드 수준에서 광분해 표시 본래 단백질 표지 연구에 기초하여, 20 배 과량 pLeu는 펩티드 수준 MBT 및 MB들을 비교하기 위해 선택되었다. 표지 된 샘플을 트립신으로 분해하고 LC-MS로 분석 하였다. 메가 시퀀스의 100 %에 해당하는 40 펩티드의 총 MBT 및 MBS 샘플 검출되었다. 라이신 및 / 또는 잔기의 Arg가 많이 표시되는 경우, 어떤 경우에는, 트립신 소화 제한된 단백질 서열 커버리지를 제공 할 수있다. 시퀀스 커버리지를 향상시키기 위해, 트립신 및 키모 트립신의 혼합물 표지 단백질을 소화하는 데 사용될 수있다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> 도 7 : 메가 대 SSPL-MS 펩티드 수준 : 메가 만화 표현 트레할로스 (A) 및 소르비톨 (B)의 존재하에 20 배 과량 pLeu (/ w w 5 %)로 표지. 표지 된 단백질을 분해시켰다 trypsin 및 표지 된 펩티드 메가의 결정 구조 (PDB ID 1WLA)에 맵핑되었다. 레이블과 레이블이없는 지역은 각각, 마젠타 및 녹색 색상이 지정됩니다. 트립신 소화 SSPL-MS는 펩타이드가 표지 된 것에 대해 정 성적 정보를 제공합니다. 손상 레벨에서 다른 표지 개체군 감안 pLeu 라벨 및 표지 및 표지 된 펩티드의 이온화 효율의 차이 무차별기구는 그 소화 후 SSPL-MS에 대한 정량적 인 지표를 얻기 어렵다. 그러나, 정 성적 정보는 여전히 펩티드 단백질 수준에서 구조 변화에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 본 연구에서는, MBT 및 MBS 두 제제는 단백질 표면의 대부분에 걸쳐 pLeu 흡수를 보였다. MBS에 비해, 펩티드 조각 32-42, 134-139과 MBT에서 146-153은 pLeu 라벨 (그림 7)를 보여 주었다. 따라서 이들 아미노산의 측쇄가 이들 레지오에 나선 같이 pLeu에 노출되는 것을 제안NS는 MBT 행렬에 그대로 있습니다. 대조적으로, MBS 매트릭스 pLeu 라벨링으로부터의 보호는 이들 영역에서 구조적 섭동 (perturbation)과 일치한다. 전반적 ssHDX-MS 및 SSPL-MS의 결과는 방법 백본 (ssHDX-MS)와 측쇄 (SSPL-MS), 동결 건조 된 단백질 제제에 노출 및 부형제의 효과에 대한 상보 고해상도 펩티드 수준의 정보를 제공 할 것을 제안 .

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

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15.7K 조회수.  Purdue University. Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design. 

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

연구

화학

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

생화학

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

생물학

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their significance to both cell physiology and immunology, much remains to be discovered about novel lipoprotein forms, how they are synthesized, and the effect of the various forms on host immunity. To enable thorough studies on lipoproteins, this protocol describes a method for bacterial lipoprotein enrichment and preparation of N-terminal tryptic lipopeptides for structural determination by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Expanding on an established Triton X-114 phase partitioning method for lipoprotein extraction and enrichment from the bacterial cell membrane, the protocol includes additional steps to remove non-lipoprotein contaminants, increasing lipoprotein yield and purity. Since lipoproteins are commonly used in Toll-like receptor (TLR) assays, it is critical to first characterize the N-terminal structure by MALDI-TOF MS. Herein, a method is presented to isolate concentrated hydrophobic peptides enriched in N-terminal lipopeptides suitable for direct analysis by MALDI-TOF MS/MS. Lipoproteins that have been separated by Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) are transferred to a nitrocellulose membrane, digested in situ with trypsin, sequentially washed to remove polar tryptic peptides, and finally eluted with chloroform-methanol. When coupled with MS of the more polar trypsinized peptides from wash solutions, this method provides the ability to both identify the lipoprotein and characterize its N-terminus in a single experiment. Intentional sodium adduct formation can also be employed as a tool to promote more structurally informative fragmentation spectra. Ultimately, enrichment of lipoproteins and determination of their N-terminal structures will permit more extensive studies on this ubiquitous class of bacterial proteins.

The enrichment of bacterial lipoproteins using a non-ionic surfactant phase partitioning method is described for direct use in TLR assays or other applications. Further steps are detailed to prepare N-terminal tryptic lipopeptides for structural characterization by mass spectrometry.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...