We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and M&#233;lissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to St&#233;phane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.

본 연구에 사용 된 모든 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 방침에 따라 마음에 든다고 및 처리되었다. HEK-293 세포를 17, 18의 일시 발현에 의해 재조합 AAV (rAAV) 1. 생산 참고 : 맥 클루 C, (2011) 19 조브를 참조하십시오. <ol><li> AAV 벡터 플라스미드의 대규모 플라스미드 제조 (적어도 1 ㎎ / ㎖)을 정제. 3 플라스미드를 사용합니다. AAV 역전 된 말단없이 복제 및 캡시드 유전자를 운반하는 AAV 헬퍼 플라스미드 LTR에, AAV ITR이 전사 플라스미드로 지칭 운반 유전자 발현 카세트, 및 아데노 바이러스 헬퍼 유전자 E2, E4 및 VA RNA 유전자를 공급하는 플라스미드를 지칭 됨 반복 pHELPER으로합니다. </li><li> 이 3 개의 플라스미드 폴리에틸렌 이민 (또는 다른 형질 전환 시약)을 사용하여 293 세포를 형질 감염. 형질 전환 효율이 80 % 이상인 양호한 VI에 필요RAL 수익률. </li><li> iodixanol 기울기에 293 세포 용 해물에서 재조합 AAV를 정화. 15 %, 25 %, 40 % 및 60 % iodixanol 그라데이션을 획득하기 위해 사용된다. , AAV 입자를 함유하는 40 % iodixanol 분획 수집 0.001 % 플루로 PBS에 대해 1 시간 및 완충액 교환 (인산 완충 생리 식염수)에 대해 500,000 XG에서 초 원심 분리 한 후 분획을 농축시킨다. </li><li> 바이러스 게놈 역가 (20)를 확인하려면, QPCR 다음에 DNase의 ProteinaseK 다이제스트를 수행합니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 AAV2 ITR 위치한 62 BP 영역을 증폭. 표준 플라스미드, 프로브는 FAM으로 표지하고 (BHQ) 소광 블랙홀 갖는다. </li><li> ITR 프라이머, 100 nM의 순방향 ITR 프라이머, 100 nM의 AAV2 ITR 프로브, 0.4 mM의 dNTPs를, 2 mM의 MgCl2를, 1X 백금의 Taq 완충액, 1U 백금 역방향가 340nm를 사용하여 25 μL의 최종 부피의 qPCR (정량적 폴리머 라제 연쇄 반응)을 수행 DNA 형성 촉매 5 μL 템플릿 (표준, 샘플 및 템플릿없이 제어). </li><li> 용표준은, 연속 희석을 배 10 7 X에 형질위한 플라스미드를 사용하여 (5 μL 10월 10일에서 10월 4일까지 게놈 / ㎖의 최종 농도에서 얻어진 2 × 109 3 10 2 × 게놈 / ㎖ 각각). </li><li> 변성의 40주기 다음에 15 분 동안 95 ° C에서 초기 변성 단계에 의해 프로그램을 시작 1 분, 어닐링 / 신장 95 ℃에서 1 분, 60 ° C에서. 단기 기억이나 장기 저장 기간 동안 -20 ℃에서 4 ℃에서 보관. </li></ol> AAV 2. 유리체 강내 주입 <ol><li> 케타민 (50 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)와 C57BL6J 마우스를 마취의 반사, 적절한 마취를 나타내는 철수 반사와 꼬리 핀치 응답을 바로 잡고의 손실을 확인합니다. neosynephrine 5 %의 각막 응용 프로그램에 의해 동공을 확장하고 안약 0.5 % mydriaticum. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 초 미세 30 G의 disposab 전달제작 : 적도를 통해 바늘과 유리체에, 윤부 옆에 (애기 K, 주피터 (2007) 21 참조). 유리체의 중심에 바늘의 직접 관찰과 ShH10-GFP 또는 AAV5-GFP의 1 10 × 4 (11) 부사장을 포함하는 1 μL 재고 (그림 1)을 주입한다. ILM 실험에 대한 제어로 한쪽 눈을 사용하십시오. BRB 실험에 두 눈을 주입한다. 주입 눈에 항 염증 항균 국소 치료를 적용합니다. </li><li> neosynephrine와 동공을 확장하고 mydriaticum 눈 이미징 떨어진다. GFP (녹색 형광 단백질) 식 일주, 이주 1 월, 유리체 강내 주입되어 2 개월 후 (그림 1)을 따라 안저 카메라로 안저 검사를 수행합니다. CO 2 흡입 1-2개월 후 주사로 쥐를 희생. </li></ol> 3. 면역 조직 화학 <ol><li> 망막 저온부 (그림 1)의 경우, L을 제거하는 탈핵 눈을 해부1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 ENS와 각막 및 침수 수정. <ol><li> 실온에서 1 시간, 실온에서 또 다른 시간 동안 20 % 수 크로즈 10 % 수크로오스에 미리 고정 눈 Cryoprotect. 밤새 4 ° C에서 30 % 자당 용액 Cryoprotect. 동결 등을 알아내는 매트릭스로 수지를 포함에 eyecups을 포함합니다. 10 μm의 저온부를 확인하고 특수 냉동 조직 절편 치료를 슬라이드에 마운트하고 그 염색시 조직의 준수를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 5 분 동안 PBS pH를 7.4에서 0.1 % 트리톤 X100와 섹션을 Permeabilize 하시려면. PBS에서 세척 배 및 블록 1 % BSA와 함께 PBS에서 실온에서 1 시간, 0.1 % 트윈 20 대. </li></ol></li><li> 망막 flatmounts (도 1)의 경우, 박리를 용이하게하기 위해 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 탈핵 쳐다. <ol><li> 15-30 분에서, 각막 및 렌즈를 제거하는 눈을 해부. ORA 세라 주위 절단함으로써 망막 색소 상피 (RPE) 및 공막으로부터 망막을 분리하고,시신경. 망막 및 형질 망막 세포에 형광 단백질 (고정이 24 시간을 초과 할 수 없습니다) 해결하기 위해 또 다른 30 ​​분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 담가. 멸균 PBS, pH가 7.4에서 5 분을 씻으십시오. </li><li> (1 % BSA, 2 % 정상 염소 또는 당나귀 혈청 PBS, 0.5 % 트리톤 X-100) 버퍼를 차단하는 PBS를 변경하고 실온에서 4 시간 또는 4 박 ° C 중 하나에 대한 버퍼를 차단에 품어. </li></ol></li><li> 실온에서 또는 4 ° C에서 하룻밤 중 4 시간 동안 차단 버퍼에 차 항체와 조직을 품어. PBS로 세척 배. 참고 : 다음과 같이 사용 된 항체는 다음과 같습니다 항 라미닌 (/ 1,000 1) 라벨 ILM, 안티 로돕신 클론 4D2 (1/500) 표시 막대, 안티 - 글루타민 합성 효소 클론 GS-6 (1 / 1,500) 라벨 뮐러 세포 , PNA 렉틴 (1/40) 라벨 콘. </li><li> 방 템피에서 1 시간 (저온부) 또는 2 시간 (flatmounts)에 대한 버퍼를 차단에 알렉사 형석 복합 이차 항체의 500 희석 : 1 조직을 품어rature와 빛으로부터 보호. PBS로 세척 배. </li><li> 망막 완화 컷을 확인하고는 광 수용체 또는 망막 신경절 세포 (RGC) 어느 한쪽이 위쪽으로 향하게하여 유리 슬라이드에 flatmount. 4 ° C에서 coverslip에 저장을 적용, 수성 mountingmedium를 추가합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 공 초점 현미경을 수행합니다. 여기 및 발광 크로스 토크를 줄이기 위해, 이미지 라인으로 순차적으로, 라인을 획득. 표본화 정리에 따라 스텝 크기를 정의합니다. 최종 이미지에 과포화 픽셀을 최소화 노출 설정을 사용합니다. Z-프로젝트 기능에서 최대 강도를 사용하여 마지막 8 비트 RGB 색상 모드로 변환 한면에 피지와 프로세스 12 비트 이미지, 프로젝트 Z 섹션. </li></ol> 마우스의 혈액 샘플 4. PCR 분석 <ol><li> 마취 C57BL6J 마우스의 음경 정맥 AAV-GFP의 1 내지 10 행 × 4 11 입자를 함유하는 100 μL 스톡 (5 % 이소 플루 란을 주입초 미세 6mm 바늘 인슐린 주사기를 사용하여 가까운 챔버 유도 및 수술 중에 코 콘을 통해 이소 플루 란의 2.5 %)에 대한. 이 동물은 AAV 입자 순환의 양성 대조군이 될 것입니다. </li><li> 주입하고 3 시간, 24 시간 2 일, 3 일 ShH10 유리체 강내 주입 후 또는 intrapenile 주입 (그림 1) 전후 마우스 꼬리에서 샘플 혈액. 약 10 ~ 20 μL 헤파린 튜브에 수집됩니다. 절차의 완료 후 CO 2 흡입 쥐를 희생. </li><li> 당신의 선택의 추출 키트를 사용하여 혈액 샘플에서 게놈 DNA를 추출합니다. </li><li> 게놈 DNA의 PCR 증폭을 수행합니다. 이 프로토콜은 다음 프라이머 쌍을 사용 GFP를, 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, 안티센스 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;을 감지. 다음 PCR 프로그램을 수행 하였다 : 95 ° C에서 2 분 (1 사이클); 95 ° C 45 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃에서 45 초 (30 회) 72 ° C 5 분 (1주기)4 ° C 유지. </li></ol> 5. 선택 에반스 블루 방법 주 : 에반스 블루 제 10 이용한 망막 혈관에서 알부민의 누설을 측정함으로써 혈관 투과성 정량화. <ol><li> 5 ㎛의 필터를 통해 5 분간 초음파 세정기에서, 여과 및 생리 식염수 (6 ㎎ / ㎖), 초음파 처리에 의해 용해 에반스 블루 염료를 준비한다. </li><li> (단계 4.1, 이소 플루 란 흡입) C57BL6J 마우스를 마취 반사, 철수 반사와 적절한 마취를 나타내는 꼬리 핀치 응답을 바로 잡고의 손실을 확인하고 음경 정맥 (그림 1)을 통해 에반스 블루 (45 ㎎ / ㎏)을 주입. 쥐의 발, 총구, 귀이, 에반스 블루 주입에 따라 염료의 흡수와 분포를 확인 명확 블루가 있는지 확인합니다. </li><li> 케타민 (50 ㎎ / kg)과 자일 라진 (10 ㎎ / kg)와 염료의 주사 후 C57BL6J 마우스에게 3 시간 및 마취 rightin의 손실을 검증g는 적절한 마취를 나타내는 리플렉스. 샘플 intracardially 500 헤파린 튜브에 혈액 μL 및 시트르산 완충액 좌심실을 통해 2 분 동안 마우스를 관류 (0.05 M, pH가 3.5, 시트르산 7.8 g, 증류수 1 L 시트르산 나트륨 3.8 g을 용해) 혈관 수축을 방지하기 위해 37 ° C로 미리 예열. 마우스는 관류를 통해 희생된다. </li><li> 신중하게 관류, 명백히하다 및 후 망막을 수집하는 운영 현미경으로 두 눈을 해부하다 (3.2 절 참조). 원심 증발기에서 건조 망막 하룻밤, 무게, 그리고 (100 XG)를 진탕 65 ° C에서 18 시간 동안 포름 아미드 100 ㎕와 망막을 배양하여 에반스 블루 염료를 추출합니다. 4 ° C에서 2 시간 동안 20,798.5 XG에 30K 오메가 필터 튜브 원심 분리기 망막 샘플 및 원심 분리기 혈액 샘플을 4 ℃에서 15 분 동안 20,798.5 XG에. </li><li> 흡광도를 측정하기 위해 두 상층 액을 사용합니다. 최대의 흡광도 FO를 감산하여 각 시료의 흡광도를 결정740 nm에서 흡광도 최소값이 620 nm에서 에반스 블루 R. 포름 아미드 에반스 블루의 표준 곡선에서 혈장과 망막 에반스 블루 농도를 계산한다. 시간당 건조 망막 (플라즈마 / g 망막 건조 중량 / 인사 μL)의 그램 당 에반스 블루의 마이크로 리터의 BRB 투과성을 표현한다. </li></ol> 6. 선택적 형광 안저 주 : 마우스에서 망막 혈관으로부터 누설 나트륨 플루오 레세 인의 복강 내 주사에 의해 시각화 될 수있다. <ol><li> C57BL6J 마우스 마취 (이소 플루 란 흡입을, 단계 4.1 참조)과 눈 (neosynephrine 및 mydriaticum)를 드랍 동공을 확장. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 형광 안저 0.1 ml의 멸균 식염수에 10 %의 나트륨 형광의 복강 0.01-0.02 ml를 주입한다. </li><li> 안저 카메라를 사용하여 주사 후 양쪽 눈의 영상을 수집한다. 프로 후 공동으로 2 흡입 쥐를 희생시저. 참고 : 망막 혈관 조영술에 표시 될 20 초 필요하다. 형광 이미지는 주사 후 3-10 분 사이에 최대 포착되어야한다. 누설 명소 (있는 경우) 2.5 분 후에 관찰 할 수 있습니다. 나중 시점에서 화질 인해 나트륨 플루오 레세 곧 분석에 사용 된 후에 얻어지는 유리체, 따라서로 이미지 만이 확산 손실된다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

BRB는 혈액과 망막 사이 분자의 교환을 제어한다. 그 내역은 당뇨병 성 망막증 또는 연령 - 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 다양한 질병과 연관된다. 우리는 최근에 투과 BRB를 표시하는 디스트로핀 넉 아웃 (knock-out) 마우스에, 망막은 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (AAV)에 의해 매개 유전자 전달에 더 관대하게 보여 주었다. 그러나, BRB 투자율 AAV 입자에도 불구하고 안구 내이 모델의 안구 구획에 국한 유...

뮐러 세포는 망막의 폐해 주요 성분이다. 형태 학적으로, 이들은, 유리체와 접촉하는 반경 방향 및 망막 endfeet을 스팬 ILM 후자의 비밀 컴포넌트를 직면한다. ILM는 약 10 가지 세포 외 기질 단백질 (라미닌, 아 그린, perlecan, nidogen 콜라겐 여러 헤파린 설페이트 프로테오글리칸)로 이루어지는 기저막이다. 개발하는 동안, 그 존재는 신경절 세포 1-3의 망막 histogenesis, 시신경 축삭의 탐색 및 생존을위한 필수적이다. 그러나, ILM 성인 망막 본질적인이고 수술 사 망막 손상시키지 않고 특정 병리에서 제거 될 수있다. 유전자 치료에있어서, 상기 멤브레인 주입술 5 AAVs를 이용한 망막의 효율적인 전달을위한 물리적 장벽이된다. 그들의 프로세스의 광범위한 arborization을 통해 뮐러 세포 영양 및 규제 suppo을 제공RT 망막 신경 세포와 혈관 세포 모두에. 뮐러 세포도 BRB (6)의 형성과 유지에, 망막 항상성의 조절에 관여한다. 꽉 접합 망막 모세 혈관 내피 세포 사이에, 뮐러 세포, 성상 세포와 혈관 주위 세포는 BRB를 형성한다. BRB는 당뇨 망막 병증, 망막 정맥 폐쇄 및 호흡기 질환 등 retina.In 많은 질병에 들어가는 특정 물질을 방지, 망막의 저산소증은 BRB 7-9을 통해 누출이 발생합니다. 이 파열은 vasogenic 부종, 망막 박리와 망막 손상으로 이어지는 혈관 투과성의 증가와 연관되어있다. 뮐러 세포와 밀접 모두 BRB ILM 무결성에 중요한 역할을하고, 혈관 기저막과 연관된다. 따라서, 뮐러 아교 세포의 레이블을 다음 망막 장벽의 물리적 상태의 연구에 특히 관련이있다. 고전적인아군, BRB 투과성 혈장 알부민 비공유 결합 에반스 청색 염료의 전신 주입 이루어진 에반스 블루 분석법을 이용하여 측정된다. 상기 분석은 망막 혈관 (10) (프로토콜 섹션 5 참조)에서 알부민 누설 (중간 크기의 단백질, ~ 66 kDa의)을 측정한다. 또한, 혈관 누출 형광의 누설 증명 형광 망막 혈관 조영술에 의해 가시화 될 수있다 (작은 분자 ~ 359 다; 프로토콜 제 6 장 참조) 11. 그럼에도 불구하고, 두 방법은 작은 분자와 단백질에 BRB 투과성의 평가를 할 수 있지만 ILM의 무결성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 따라서, BRB 투과성 공부, 우리는 큰 분자 (예를 들어, AAV 입자, 25 nm의 직경)에 BRB 투과성에 대한 정보를 제공 AAV 기반 방법을 사용 하였다. 사실, 우리의 방법은 그 제안하는 혈액에 AAV 전이 유전자의 존재를 감지 할 수 있습니다 ~ 25 nm의 직경 입자 것혈류로 침투 할 수 있습니다. 이 방법은 또한, 병리 적 상태의 ILM 및 세포 외 기질 단백질의 구조에 대한 정보를 제공한다. 두 AAV 변종은 연구에 유용 : AAV5 및 ShH10. Subretinally 주입, AAV5은 광 수용체와 망막 색소 상피 (12)에 대한 자연적인 굴곡 운동이 있지만 그대로 ILM 5,13 야생 형 망막의 유리체에 투여시는 외부 망막에 걸쳐 얻을 수 없습니다. ShH10 특별히 신경 세포 (14, 15)을 통해 아교 세포를 대상으로 설계되었습니다 AAV의 변종이다. ShH10 선택적으로 손상된 장벽 (16)와 망막의 효율성 향상과 건강하고 병에 걸린 망막 모두에서 뮐러 세포 레이블. immuhistochemistry 및 혈액 DNA 분석과 결합 된 이러한 바이러스 도구 망막 장벽의 상태 및 질환에서의 관여 (도 1)에 대한 정보를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>C57BL6J mice strain</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>mice</td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Neosynephrine 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>dilatant</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td><td>Thea</td><td></td><td>dilatant</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>anti-inflammatory</td></tr><tr><td>Cryomatrix embedding resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>slides</td></tr><tr><td>anti-laminin</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>antibody</td></tr><tr><td>anti-rhodopsin clone 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>antibody</td></tr><tr><td>anti-glutamine synthetase clone GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td><td>Dako</td><td>334</td><td>antibody</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>probe</td></tr><tr><td>Alexa fluor conjugated secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>antibody</td></tr><tr><td>Fluorsave reagent</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>mounting medium</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>dye</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamide spectrophotometric</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>dye</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td></tr><tr><td>Insulin Syringes</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 &amp;micro;l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Needle RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Intravitreal Injection</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td><td>UMP3-1</td><td>Digital controller</td><td></td></tr><tr><td>Binocular magnifier SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection</td></tr><tr><td>Spring scissors straight - 8.5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Retinas dissection</td></tr><tr><td>curved Vanna scissor</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life technologies</td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Laboratory Supplies</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k omega tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>TECAN</td><td>infinite M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using adeno-associated virus as a tool to study retinal barriers in disease

뮐러 세포는 망막의 주요 신경교 세​​포이다. 최종 - 피트는 외측 및 내측 제한 멤브레인 (ILM)에서 망막의 한계를 형성하고, 성상 세포, 외막 세포 및 내피 세포와 함께 이들은 혈액 망막 장벽 (BRB)을 확립한다. ILM은 망막과 유리체 사이에 조직 학적 경계를 정의하는 기저막 역할을하면서 BRB는 혈류와 망막 사이의 물질 이동을 제한합니다. 뮐러 세포 레이블링이 세포는 BRB와 ILM의 중요한 부분으로, 망막 장벽의 물리적 상태를 연구하는 것이 특히 관련이있다. BRB와 ILM 모두 자주 망막 질환에서 변경 및 질병 증상에 대한 책임이 있습니다. 이러한 에반스 블루 분석 또는 형광 안저 촬영 등의 BRB의 무결성을 연구하는 몇 가지 잘 확립 된 방법이있다. 그러나 이러한 방법들은 BRB 투과도 (T)의 범위에 대한 정보를 제공하지 않는다나노 미터 범위의 더 큰 분자, O. 또한, 그들은 같은 ILM 다른 망막 장벽의 상태에 대한 정보는 제공하지 않는다. 망막 ILM과 함께 BRB 투과성을 연구하기 위해, 우리는 질병 상태의 ILM과 세포 외 기질 단백질의 상태를 나타내는 동안 큰 분자 BRB의 투과성에 대한 정보를 제공 AAV 기반의 방법을 사용했다. 두 AAV 변종은 연구에 유용 : AAV5 및 ShH10. AAV5은 광 수용체에 대한 자연적인 굴곡 운동이 있지만 ILM이 손상되지 않은 경우 (야생 형 망막에 즉,) 유리체에 투여시는 외부 망막에 걸쳐 얻을 수 없습니다. ShH10는 신경 교세포 대한 강한 향성을 가지고 있으며, 선택적으로 건강하고 병에 걸린 망막 모두에서 뮐러 아교 세포 레이블을 것입니다. ShH10는 ILM이 손상되어 망막에보다 효율적인 유전자 전달을 제공합니다. 면역 조직 화학 및 혈액 DNA 분석과 함께 이러한 바이러스 도구는 질병 망막 장벽의 상태에 빛을 흘렸다.

동물 모델은 ILM (- B도 2a)의 구조를 도시 섭동 있다면 우리는를 사용 ShH10 뮐러 글 리아 세포의 형질 도입을 증가 망막 예상된다. 예를 들어, 우리가 Dp71의 부재에 그를 보여, ShH10 목표를 구체적으로하지만, 더 효율적으로 뮐러 야생형 마우스 (16) (그림 2C - F)에 비해이 마우스 라인에서 ILM의 투과성 증가를 나타내는 유리체 강내 주입하여 신경 교세포. </...

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Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K 조회수.  Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968. To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

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Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

연구

신경과학

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

의학

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Single-Step Heparin Affinity Chromatography를 이용한 AAV 벡터 정제

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

저자 스포트라이트: Adeno-Associated Viral Vectors의 생산 및 정제를 위한 개선된 방법

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

생체공학

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of AAV transduction is usually critical, which affects the overall experimental outcomes. One of the main determinants for transduction efficiency is the serotype or variant of the AAV vector. Currently, various artificial AAV serotypes and variants are available with different affinities to host cell surface receptors. For retinal gene therapy, this results in varying degrees of transduction efficiencies for different retinal cell types. In addition, the injection route and the quality of AAV production may also affect the retinal AAV transduction efficiencies. Therefore, it is essential to compare the efficiency of different variants, batches, and methodologies. The digital droplet PCR (dd-PCR) method quantifies the nucleic acids with high precision and allows performing absolute quantification of a given target without any standard or a reference. Using dd-PCR, it is also feasible to assess the transduction efficiencies of AAVs by absolute quantification of AAV genome copy numbers within an injected retina. Here, we provide a straightforward method to quantify the transduction rate of AAVs in retinal cells using dd-PCR. With minor modifications, this methodology can also be the basis for the copy number quantification of mitochondrial DNA as well as assessing the efficiency of base editing, critical for several retinal diseases and gene therapy applications.

This protocol presents how to quantify AAV transduction efficiency in mouse retina using digital droplet PCR (dd-PCR) together with small scale AAV production, intravitreal injection, retinal imaging, and retinal genomic DNA isolation.

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

요약

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마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질