Name: a whole cell bioreporter approach to assess transport and bioavailability of organic contaminants in water unsaturated systems
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems at JoVE.com

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit W&#252;rz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the &#8216;Chemicals in the Environment&#8217; (CITE) research program of the Helmholtz Association.

요리, 슬라이드 배양 챔버 1. 준비 <ol><li> 각각의 소우주에 대해 다음 재료를 준비합니다 하나의 큰 플라스틱 페트리 접시 바닥 (D = 10cm), 수정 (단계 1.2 참조) 뚜껑 작은 플라스틱 페트리 접시 바닥 (D = 5cm)과 세 충치 하나의 계산 챔버 슬라이드. </li><li> 페트리 접시 바닥 부분의 원하는 번호 (D = 5cm)를 가져 가라. 정확히 슬라이드 (26mm 에지 길이)에 맞게 톱으로 가장자리의 일부를 제거합니다. 시스템을 소독하기 위해 70 % 에탄올 O / N에서 배양 접시 바닥과 뚜껑을 담가 UV 빛 아래 흐름 캐비닛에 최소 2 시간 동안 건조한다. 또한 2 시간 동안 자외선에 노출되었던 단단히 밀봉 플라스틱 용기에서 배양 접시를 저장합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 슬라이드의 원하는 번호 닦아을 공기를 말린다. 알루미늄 호일에 슬라이드를 감싸고 가능한 오염을 제거하기 위해 450 ℃에서 5 시간 동안 머플에 넣어. </리&gt; <li> 뚜껑 유리 배양 챔버를 준비합니다. 70 % 에탄올로 청소하고 흐름 캐비닛에 최소 2 시간 동안 자외선에 열려있는 챔버를 노출합니다. 주 : 뚜껑 큰 데시 케이 터 (직경 약 30cm)가이 목적을 위해 이용 될 수있다; 각 데시 케이 터 10 소우주의 설정까지 수용 할 수 있습니다. </li></ol> 미디어 및 문화 2. 준비 <ol><li> 수정 트립 효모 매체 (MTY) 14, 21 세기 최소한의 매체 (16) (MM)의 약 150 ml의, 최소 배지 한천 5 ㎖를 100 ㎖ 구 (20) 병렬 소우주를 실행하려면, 세 (MMA, 0.5 % / V w) 감자 덱 스트로스 한천 플레이트 (PDA; 1.5 %, w / v)를 용 P. ultimum, 4 빈 접시, 2 mg을 L -1 사이클로 헥, 네 아가 플레이트를 포함하는 하나 PDA 판 (3 %, w / v)의 0.3를 포함 g ml의 -1 활성탄 2 mg의 부분에서 독감의 40 mg을. </li><li> MTY 카나마이신의 50 mg을 L -1을 포함 준비 (카나마이신은의 requir입니다ED는 세균 배양을위한 10 mM의 아세테이트를 포함하는 eGFP는 기자 플라스미드)과 MM을 유지합니다. 소우주에서 박테리아의 고정화 0.5 % MMA를 준비하는 아세테이트없이 MM를 사용 Pythium의 ultimum와 소우주 설정 배양에 1.5 %의 PDA의 판 (각 20 ml)에 붓는다. </li><li> P.의 일부 균사를 접종 세 신선한 PDA 판에 ultimum과는 약 72 시간 동안 25 ° C에서 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 판 신선한 솜털 균사체에 의해 완전히 자란되어 있는지 확인하십시오. </li><li> B의 두 문화를 시작합니다 글리세롤 주식에서 MTY 50 ㎖에 sartisoli RP037-mChe. 230 rpm으로 회전 플라스크 운동 O / N 30 ° C에서 품어. </li><li> 측정 문화 광학 밀도 (OD) 578 nm에서 원심 분리기 10 분 동안 1,000 XG에 (B. sartisoli RP037-mChe를 들어, 예상 OD (578)은 약 1.0이고, 세포는 지수 상에있다). 뜨는을 취소하고 세포를 다시 일시 중지MM의 적당량 0.4 OD 578에 도달한다. 50 mg을 L -1 재현 탁 세포의 400 μL와 카나마이신을 포함하는 MM 20 ㎖를 접종한다. 230 rpm으로 회전 플라스크 운동 O / N 30 ° C에서 품어. </li><li> MM의 문화의 OD 578을 측정 (B. sartisoli RP037-mChe를 들어, 예상 OD (578)은 약 0.2이고 세포는 초기 지수 단계에있다). 원심 배양은 10 분 2,000 XG 0.4의 OD에 도달하는 MM의 적절한 양으로 세포를 재 중단. 사용 때까지 50 ° C에서 셀 2 ml의 튜브에 따뜻한 액체 MMA의 500 μL와 서스펜션과 상점의 50 μl를 섞는다. 각각의 소우주에 대한 MMA에서 세포의 150 μl를 사용합니다. </li><li> 활성 탄소를 포함하는 아가 로스 젤의 판을 따르십시오. 융해 (3 % W / V)을 두 번 증류수. (g ml의 -1 0.3)를 활성탄으로 잘 혼합 플라스틱 페트리 접시에 혼합물을 부어(D = 10cm). </li></ol> 설치 3. 소우주 참고 :. 완벽한 소우주 설정이 그림 1에 개략적으로 도시 모든 다음의 각 단계는 그림 1을 참조하십시오. 다음 단계는 균사 전송 벡터와 세 가지 제어 설정 (CON 공기, CON의 NEG, CON의 POS)과 샘플 (SAM)의 제조 방법을 설명한다. 모든 다른 설정의 요약은 표 1에서 찾을 수있다. <ol><li> 배양 접시와 슬라이드의 원하는 번호를 가지고 30 분 동안 흐름 캐비닛에서 자외선에 노출. </li><li> 큰 하나 내부의 작은 페트리 접시를 놓고 작은 페트리 접시의 갭을 ​​통해 슬라이드를 맞습니다. MMA의 따뜻한 세포 현탁액의 하나의 샘플을 가지고 하나의 슬라이드의 중간 공동으로 150 μl를 추가합니다. 모든 슬라이드의 중간 충치가 될 때까지이 단계를 반복합니다MMA 가득합니다. MMA 응고 5 분을 기다립니다. </li><li> 빈 PDA 판에서 원형의 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 작은 페트리 접시 내부의 MMA 옆에 2mm의 거리에서 하나의 패치를 놓습니다. (그림 1의 PDA 3) 설정에서 균사 생장을 촉진하기 위해이 추가. </li><li> 기계적 장벽 곡선 된 PDA 패치를 잘라. 깨끗하고 무균 작은 배양 접시 바닥 부분을 사용하여 PDA 판으로 누르십시오. PDA 링 결과 한천에 0.5 cm의 거리에서 또 다른 작은 반지를 잘라 주걱을 사용합니다. <ol><li> 정확히 소우주 설정에서 작은 페트리 접시의 격차에 맞는 조각을 잘라 슬라이드의 상단에 격차 내부에 배치합니다. MMA와 원형 PDA 장벽 사이의 거리가 약 2mm 있는지 확인하십시오. 부드럽게 PDA 장벽으로를 누르면 작은 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 반복 2g의 L를 포함하는 PDA 플레이트 3.4과 3.4.1 단계 -1의 사이클로 헥. 참고 : 균사가 cycloheximide에 의해 억제되고 MMA를 자라다하지 않기 때문에 이것은 bioreporter 세포를 향해 공중 수송 (CON의 AIR)에 대한 제어 설정입니다. </li></ol></li><li> 빈 PDA 판의 원형 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 첫 번째 패치의 중간을 잘라 다른 0.5 cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. PDA 장벽 (그림 1의 PDA 1) 옆에 1mm의 거리에서 결과 작은 PDA 링을 놓습니다. </li><li> PDA 1.의 구멍 P.와 함께 자란 PDA 판에서 원형 패치를 잘라 1cm 코르크 구멍 뚫는에 독감의 2 mg을 추가 ultimum 및 균사 매트 독감 결정을 향하도록 PDA 링에 내려 바닥 (그림 1의 PDA 2) 하나의 패치를 배치합니다. <ol><li> 독감 결정을 추가하지 않고 이전 단계를 반복합니다. 참고 :이 배경을 결정하는 음성 대조군 설정 (CON NEG)입니다bioreporter 세포의 형광. </li></ol></li><li> 활성 탄소를 포함하는 배지에서 원형 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 또한 가스 독감 농도 (그림 1)을 감소하기 위해 각 축소판 설정에서 네 개의 패치를 놓습니다. </li><li> 양성 대조군 (CON의 POS)를 준비합니다. MMA 세포 현탁액 200㎕의 일부 독감 결정을 추가하고 빈 슬라이드 중 하나 캐비티에 넣어. </li><li> 챔버 내의 가스 독감 농도를 최소화하기 위해 배양 챔버의 바닥에 활성탄의 일부 가루와 함께 페트리 접시 (D = 10cm)를 놓습니다. 또한, 실내의 습도를 유지하기 위해 바닥에 멸균 물 4-5 50 ㎖ 비커를 놓습니다. <ol><li> 배양 챔버에 소우주의 설정을 전송하고 96 시간 동안 25 ℃에서 배양한다. 무작위로 다른 성장 챔버에 넣어 샘플 위치 효과를 제외한다. 참고 :이 배양 시간 AP = 연합 뉴스난균 강 P.에 플라이 ultimum. 그것은 다른 생물 다를 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 공 초점 레이저 주사 현미경 <ol><li> 이상적으로 직립 현미경으로 CLSM 설정을 사용합니다. 주 : 기존의 레이저 제공하는 예를 들어, 여기에 대한 또는 조정 가능한 흰색 레이저 소스와 488, 561 및 633 nm의 라인을 갖추고 할 수있다. </li><li> 인가 전압 : 이미지의 수집을 위해 다음과 같은 설정을 사용하여 490 nm의 (eGFP는) 적절한 레이저 강도 (동시 여기)에서 585 나노 미터 (mCherry); 방출 범위 : 500 550 나노 미터 (eGFP는)과 605-650 nm의 (mCherry)에; 대물 렌즈 (인해 긴 작동 거리) 63X NA 0.9 물 침수; 0.5 μm의 : Z-스택에 대한 스텝 크기. </li><li> 오픈 축소판 설정 및 PDA 1, 2, 3, PDA 장벽을 제거하기 위해 메스를 사용한다. MMA의 상단에 유리 커버 슬립을 넣고 기포를 제거하기 위해 부드럽게 누르십시오. 현미경 무대에 마운트 슬라이드. 제 위에 물방울을 추가전자 커버 슬립과 시료의 bioreporter 세포를 찾기 위해 mCherry 설정을 사용합니다. </li><li> 샘플의 빠른 개요를하고 글로우 - 이상 - 아래 룩업 테이블 적색 (mCherry)과 녹색 (eGFP는) 채널을 사용하여 신호 대 잡음 비율을 최적화 할 수 있습니다. bioreporter 형광을 분석 할 수있는 샘플에 임의의 위치를​​ 선택합니다. 참고 : 균사는 bioreporter 배출 (예를 들어, 녹색 형광도) 17의 범위에서 형광도를 표시 할 수 있습니다. 이 경우 경우 균사없이 영역을 선택해야합니다. </li><li> 정의하고 녹색 (eGFP는)과 적색 (mCherry) 채널의 각 위치를 Z-스택을 기록한다. 표면 형광 빛 또는 레이저 빛에 오래 노출하여 샘플의 표백을하지 마십시오. <ol><li> 열 무작위로, 균일하게 분포 된 위치를 반복 이전 단계. </li></ol></li><li> 테스트 트랙 (SAM), CON 공기, CON의 NEG와 CON의 POS의 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용하여 모든 단계를 반복합니다. </li></oL&gt; 5. 이미지 분석 참고 : 다른 옵션 사이에 자유 소프트웨어 ImageJ에 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)이 될 수 있습니다, 기록 된 Z-스택에 적색 (mCherry)과 녹색 (eGFP는) 형광을 분석하려면 사용. <ol><li> logi_tool 플러그인 (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/)를 설치해야합니다. </li><li> ImageJ에있는 파일을 엽니 다. &quot;분할 채널&quot;과 가까이의 녹색 채널을 선택합니다. Z-스택에 빨간색 형광의 영역을 정량화하는 보조 코드 파일로 제공 매크로 &#39;mCherry 영역&#39;을 사용합니다. 매크로에서 기본 설정을 조정합니다 (볼드체로 표시). <ol><li> 출력 Z- 스택에서 측정 된 픽셀 임계 값보다 (그리고 정의 된 최소 크기 이상)와 테이블입니다. 주 : 모든 값의 합계는 스택에 빨간색 픽셀 (영역)의 총 수입니다. </li></ol></li><li> ImageJ에있는 파일을 엽니 다. &quot;분할 채널 &#39;과 가까운 빨강 채널을 선택합니다. 매크로를 사용하여<html> (216), 보조 코드 파일로 제공 eGFP는의 INT는 &#39;Z- 스택에 녹색 형광의 강도를 정량화한다. 매크로에서 기본 설정을 조정합니다 (볼드체로 표시). <ol><li> 출력 Z-스택의 모든 녹색 객체 임계 값보다 (그리고 정의 된 최소 크기 이상)의 평균 농도와 면적 테이블입니다. 스택에서 녹색 화소의 총 강도를 계산하기 위해, 각각이 대응하는 영역에 의해 강도를 의미 곱한다. </li></ol></li><li> 상대 eGFP는 유도 (eGFP는 확인해)를 계산한다 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) 주 : mCherry는 항시 적으로 발현되므로, eGFP는 확인해의 결과 값이 셀들의 특정 량에 의해 표현 eGFP는 양의 상대 척도이다. 또한 eGFP는 확인해 계산에 대한 자세한 내용은 표 3을 참조하십시오. </li></ol>TLE &quot;&gt; 6. 화학 정량화 주 : 소우주 셋업도 또는 비 생물학적 오염물 싱크없이 전좌 FLU 량의 화학 정량을 수행하는데 사용될 수있다. <ol><li> 알루미늄 호일에 15 ml의 유리 병, 1 ML의 GC / MS 튜브 및 삽입을 바꿈. 나 2 SO 4 요리를 증발 채우 가능한 오염을 제거하기 위해 450 ℃에서 5 시간 동안 머플의 모든 놓습니다. 활성화 된 데시 케이의 나 2 SO 4 내부를 저장합니다. </li><li> 0.5 cm 길이로 PDMS 코팅 된 유리 섬유를 잘라. 신선한 메탄올 4 회 2 시간을 흔들어 섬유를 씻으십시오. 반복 세탁은 밀봉 된 유리 병에 초순수에서 초순수 및 저장 깨끗한 섬유와 또 다른 4 번 단계를 반복합니다. </li><li> (: 1, v / V를 3)를 포함 10 μg의의 L -1 페난 트렌-D 10 톨루엔 / 아세톤 1.5 L를 준비합니다. </li><li> 단계 1, 2, 프로토콜의 3을 수행합니다. bior없이 소우주를 준비독감 저하를 확인하고 bioreporter 세포 (SAM)와 () - (-)와 콘 AIR SAM () eporter 세포는 독감 전송을 연구한다. <ol><li> (bioreporter 세포없이) 옵션 : SAM의 MMA 내부 인공 및 정량화 할 수있는 오염 물질 싱크 (일반적으로 SPME 실험에 사용) 유리 섬유 코팅 장소 세 PDMS (-)를 미세 집게를 사용. </li><li> 미세 집게를 사용하여 유리 섬유를 제거하고 삽입과 GC / MS 유리 병에 각각 전송합니다. </li><li> 톨루엔의 200 μl를 추가하고 수직 O / N을 흔들 GC / MS를 통해 분석 할 수 있습니다. 표 2에서 제공되는 설정을 사용합니다. </li></ol></li><li> 15 mL 유리 병에 중간 공동에서 MMA를 전송하고 SO 4 나 2 세 주걱에 대해 추가합니다. 철저하게 주걱을 사용하여 혼합 용매 10 ㎖를 추가합니다. 소용돌이 혼합물과 어둠 속에서 수평으로 O / N를 흔들. <ol><li> 전송 (100)1, 삽입, GC / MS 유리 병에 시료의 리터. 아세 나프 틸렌 08-D (10 mg을 L-1) 10 μl를 첨가하고, 6.4.3에 기술 된 바와 같이 동일한 프로그램을 사용하여 GC / MS로 분석한다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interest.

제시된 소우주 설정은 균사체에 의한 흡수와 수송 후 생물 분해에 공간적으로 분리 된 화학 물질의 생체 이용률을 연구하기에 적합 증명했다. 부분적 휘발성 화합물의 잠재적 기상 수송이 방지된다 bioreporter 박테리아 세포 성 시스템으로의 방해를 최소화하므로 정교한 시료 전처리없이 가시화 될 수있다. 동시에, 시료의 화학적 분석을 용이 얻은 결과 양호한 제어 및 전송의 총 수 정량을 실시 할...

토양은 밀도가 박테리아 같은 미생물 1, 2의 넓은 범위에 의해 채워집니다. 그러나,이 서식지의 조건은 특히 물 이용 3의 관점에서, 도전이다. 박테리아는 영구적 이종 환경에서 최적의 조건 (4)를 검색 할 필요가 있지만, 물의 연속 필름 부재는 자유롭게 확산을 방해하도록 제한된 이동성 5 초래된다. 또한, 용질의 확산 속도 (예를 들어, 양분) 불포화 조건 하에서 6 낮아진다. 따라서, 박테리아와 영양분은 종종 물리적으로 분리하고 영양 접근성은 3 제한됩니다. 결과적으로, 물이 연속 상을 요구하지 않는 화학 물질에 대한 전송 벡터는 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 있었다. 사실, 균류 및 oomycetes 많은 미생물하여 도달 모비 공기로 채워진 기공 공간을 통해 성장 할 수 있도록 사상 성장 양식을 개발했다LIZING는 실제 장거리 영양소 7, 8 탄소 물질을 분리. 심지어 박테리아 9 당 및 기타 에너지 원을 제공하는 생물학적 전송 벡터로서 작용할 수있다. 통풍 및 균사 생물의 전송은 또한 Pythium ultimum 10 또는 arbuscular mycorrhizal 곰팡이 (11)의 다환 방향족 탄화수소 (PAH)와 같은 소수성 유기 오염 물질에 대한 나타났다. PAH는 유비쿼터스 저조한 수용성 오염 물질이 토양에 12이기 때문에, 균사 매개 교통 잠재적 인 세균 degraders에 대한 오염 물질의 생체 이용률을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오염물 수송 총량 케미컬 직접 정량화 될 수있는 반면 분해 세균 및 다른 생물체에 의해 수송 균사 오염물 생체 이용률 쉽게 평가 될 수 없으며, 10을 의미한다. 다음 프로토콜 myce의 영향을 평가하기위한 방법을 제시직접 방식으로 세균 degraders에 오염 물질이 생체 이용률에 대한 LIA; 이 미생물 생태계에 오염 물질의 시공간에 미치는 영향에 대한 정보를 수집 할 수 있습니다. 우리는 어떻게 균사 전송 경로를 통해 PAH-굴욕 bioreporter 박테리아와 물리적으로 분리 된 PAH 포인트 소스를 연결하여 토양에 공기 - 물 인터페이스를 흉내 낸 정교한 불포화 소우주 시스템을 설정에 대해 설명합니다. 항공 운송은 제외되어 있기 때문에, 세균 PAH의 생체 이용률에 균사 기반 전송의 효과는 격리 방법으로 공부하실 수 있습니다. 보다 구체적으로, 세 개의 링 PAH 플루 오렌, 균사 유기체 Pythium ultimum과 bioreporter 박테리아 부르크 홀데 리아 sartisoli RP037-mChe (13)는 설명 소우주의 설정에 적용되었다. 세균 B. sartisoli RP037-mChe는 원래 셀 (14)에 페난 트렌 플럭스을 연구하기 위해 지어졌습니다에 PAH 플럭스의 결과로 녹색 형광 단백질 (eGFP는)을 강화 표현한다mCherry는 항시 적으로 발현되는 반면, 적색 형광 셀. 기자의 구성에 대한 자세한 정보는 TECON 등. 예비 시험에서 (13)에 의해 제공됩니다, 세균은 수영과 매우 느린 득시글 거리는 능력을 보이지 않았다. 그것은 균사의 상단에 조밀 한 서스펜션으로 적용 할 때 Pythium의 ultimum의 균사에 천천히 마이그레이션 할 수 있었다. 박테리아가 다음과 같은 프로토콜의 아가로 오스에 포함 되었기 때문에, 균사에 이주가 발생하지 않았다. 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 이용하여, bioreporter 박테리아는 소우주 직접 시각화 될 수 있고 eGFP는 표현은 소프트웨어 ImageJ에의 도움으로 (mCherry 신호에 비례) 세포의 양과 관련하여 정량화 할 수있다. 이것은 다른 시나리오에서 질적으로 생체 이용률을 비교 할 수 있습니다 (즉, 높거나 낮은). 독감은 P.에 의해 균사 전송 후 생물학적 인 것으로 밝혀졌다 ultimum (즉, 그것을) 음성 대조군보다 높았다. 또한, 프로토콜은 화학적 수단을 통해 매개 된 수송 균사의 총량을 정량화하고 동일한 소우주 규소 코팅 된 유리 섬유 (SPME 섬유)를 사용하여 생체 이용률 오염물을 확인하는 방법을 설명합니다. 이 소우주 설정을 사용하여 결과 발표 및 P.의 조합에 대해 논의되었다 ultimum, 플루 오렌 및 B. sartisoli RP037-mChe 15. 여기서, 초점은 상기 애플리케이션에 대한 가능성이 기술을 제공하는 방법의 상세한 설명 및 프로토콜의 전위 함정 식별에 놓여있다. 또한 응용 프로그램 (오염 된 사이트의 예) 각종 곰팡이, 박테리아 종을 포함, 및 기타 오염 물질 (예를 들면, 농약) 또는 오염 물질 공급 (예를 들어, 세 토양) 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>an equivalent GC/MS may be used</td></tr><tr><td>GC capillary column J&amp;amp;W 121-5522&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork borer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>or any other</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>High performance, No.1.5H</td></tr><tr><td>GC/MS insterts</td><td>WICOM</td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS vials 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Lids / septa for screw cap vials</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lids for GC/MS vials</td><td>WICOM</td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Objective Slides</td><td>Menzel</td><td></td><td>ordinary</td></tr><tr><td>PDMS coated glass fibers</td><td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13.55&amp;nbsp;&amp;plusmn;&amp;nbsp;0.02&amp;nbsp;&amp;micro;l&amp;nbsp;m&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Petri Dishes small / big</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap vials 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>other glass vials may be used</td></tr><tr><td>Screw cap vials 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>other glass vials may be used</td></tr><tr><td>Acenaphthylene d&lt;sub&gt;08&lt;/sub&gt;</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Activated carbon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorene</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>P7171</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Minimal Medium:&lt;/strong&gt; 100 ml &lt;strong&gt;Solution 1&lt;/strong&gt; + 25 ml &lt;strong&gt;Solution 2&lt;/strong&gt; + 5 ml &lt;strong&gt;Solution 3&lt;/strong&gt; ad. 1,000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Solution 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L&lt;sup&gt;-1&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Magnesium chloride x 6&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Calcium nitrate x 4&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0.5 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Solution 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55.83 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Solution 3&lt;/strong&gt; (pH 6.0)</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>MERCK</td><td>1084180250</td><td>0.8 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Iron(II) chloride x 4&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>MERCK</td><td>1038610250</td><td>0.3 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cobalt(II) chloride x 6&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride x 1&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Sodium molybdate x 2&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Zinc chloride</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Lithium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0.5 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tin(II) chloride x 2&amp;nbsp;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>4473.1</td><td>0.5 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Riedel-de-Haen&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11606</td><td>1 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Potassium bromide</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Potassium iodide</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Barium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0.5 mg L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Minimal medium + agarose 0.2%</td></tr><tr><td>Phenanthrene d&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Potato Dextrose Agar:&lt;/strong&gt; 24 g L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt; broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8</td></tr><tr><td>Potato Dextrose broth</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;mTY medium:&lt;/strong&gt; 3 g&amp;nbsp;L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt; yeast extract, 5&amp;nbsp;g&amp;nbsp;L&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt; bacto tryptone and 50 mM NaCl</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ with logi tool plugin</td><td></td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pythium ultimum&lt;/em&gt; strain 67-1</td><td></td><td></td><td>Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Burkholderia sartisoli&lt;/em&gt; RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland</td></tr></tbody></table>

a whole cell bioreporter approach to assess transport and bioavailability of organic contaminants in water unsaturated systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

여기에 제시된 결과는 이미 이전에 15 발표되었다. 자세한 기계적 및 환경 논의에 대한 문서를 참조하십시오. CLSM 통한 화상 기록 후, 최대 강도 투영 시료의 제 시각적 인상 제어 (도 2)를 얻기 위해 각각의 현미경 ImageJ에 또는 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수있다. 이후, 상기 데이터 세트는 특정 시각화 소프트웨어에 의해 의미있는 특징을 보여주기 위...

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A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

부르크 홀데 리아의 sartisoli RP037-mChe와 전 세포 bioreporter 분석은 물 불포화 모델 시스템에서 공기로 채워진 모공을 해소 균사체에 의한 능동 수송 후 세균 분해 가능한 유기 오염 물질 (즉, 플루 오렌)의 분수를 감지하기 위해 개발되었다.

전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

10.3K 조회수.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ.  부르크 홀데 리아의 sartisoli RP037-mChe와 전 세포 bioreporter 분석은 물 불포화 모델 시스템에서 공기로 채워진 모공을 해소 균사체에 의한 능동 수송 후 세균 분해 가능한 유기 오염 물질 (즉, 플루 오렌)의 분수를 감지하기 위해 개발되었다. 

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Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판<em&gt; 체외</em&gt; 전이 활성화 생물학적 정량

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

연구

환경과학

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under physiologically relevant conditions.1 These measurements are performed on living biofilms in aqueous medium using source and drain electrodes patterned on a glass surface in a specialized configuration referred to as an interdigitated electrode (IDA) array. A biofilm is grown that extends across the gap connecting the source and drain. Potentials are applied to the electrodes (ES and ED) generating a source-drain current (ISD) through the biofilm between the electrodes. The dependency of electrical conductivity on gate potential (the average of the source and drain potentials, EG = [ED + ES]/2) is determined by systematically changing the gate potential and measuring the resulting source-drain current. The dependency of conductivity on gate potential provides mechanistic information about the extracellular electron transport process underlying the electrical conductivity of the specific biofilm under investigation. The electrochemical gating measurement method described here is based directly on that used by M. S. Wrighton2,3 and colleagues and R. W. Murray4,5,6 and colleagues in the 1980&#39;s to investigate thin film conductive polymers.

A protocol for measuring electrical conductivity of living microbial biofilms under physiologically relevant conditions is presented.

특성화 생활 Biofilms 통해 전자 전송

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

화학

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

생체공학

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

생물학

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical cores. Following adsorption of a prime layer and DNA plasmids, the formation of robust microcapsules was facilitated by inducing &#946;-sheets in silk secondary structure during acute dehydration of a single silk layer. Hence, the layering occurred via multiple hydrogen bonding and hydrophobic interactions. Upon adsorption of multilayered shells, the core-shell structures can be further functionalized with gold nanoparticles (AuNPs) and/or antibodies (IgG) to be used for remote sensing and/or targeted delivery. Adjusting several key parameters during sequential deposition of key macromolecules on silica cores such as the presence of a polymer primer, the concentration of DNA and silk protein, as well as a number of adsorbed layers resulted in biocompatible, DNA-laden microcapsules with variable permeability and DNA loadings. Upon dissolution of silica cores, the protocol demonstrated the formation of hollow and robust microcapsules with DNA plasmids immobilized to the inner surface of the capsule membrane. Creating a selectively permeable biocompatible membrane between the DNA plasmids and the external environment preserved the DNA during long-term storage and played an important role in the improved output response from spatially confined plasmids. The activity of DNA templates and their accessibility were tested during in vitro transcription and translation reactions (cell-free systems). DNA plasmids encoding RNA light-up aptamers and riboswitches were successfully activated with corresponding analytes, as was visualized during localization of fluorescently labeled RNA transcripts or GFPa1 protein in the shell membranes.

The protocol describes the formation of robust and biocompatible DNA-laden microcapsules as multiplexed in vitro biosensors capable of tracking several ligands.

RNA 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...