Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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우리는 도움이 토론 전체 Koshy 실험실 감사합니다. 우리는 패티 Jansma과 조언을 애리조나 신경 과학학과의 대학 감사 및 이미징에 도움이됩니다. 우리는 또한 자신에 vibratome의 사용을 Porreca 실험실 감사합니다. 이 연구는 미국 국립 보건 연구소 (NIH NS065116, AAK)에 의해 지원되었다.

참고 : 마우스는 아리조나 대학에서 음식과 물을 사용할 수 임의로 빛 / 어둠주기를 반전 사육 12 시간과 온도 및 습도 조절 실에서 유지되었다. 실험 지침과 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 실시 하였다. 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. Cre 호텔 - 기자 마우스 C57BL / 6 배경 (11)에 있으며 상업적으로 사용할 수 있습니다. 1. 마우스 감염 참고 : - (12) 아래에 설명 톡소 포자충와 마우스 감염의 방법은 이전에 10 발표 된 연구에 사용되어왔다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 섬유 아세포 (HFFS) 인간 포피 톡소에서 균주를 성장 둘 베코 고혈당 배양 이글스 중간 (DMEM)를 10 % FBS가 보충 된 수정, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ strept5 % CO 2 인큐베이터 안에서 T-25 플라스크에서 omycin, 및 2 mM L- 글루타민 (cDMEM)는 기생충 큰 parasitophorous 액포가 형성 될 때까지. </li><li> 다음, 27 게이지 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기 경우에 모든 용액을 전송 플라스크 내부의 2 배를 플라스크의 바닥으로부터 세포를 긁어 및 3 ㎖ 주사기에 연결된 25 게이지 바늘을 통해 생성 된 용액을 통과시킴으로써 주사기 용출 기생충 그 거꾸로 15 ML 원뿔 관 내부에 배치되었습니다. 주사기 플런저를 연결하고 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 전달합니다. </li><li> 원심 분리기 (300)의 X g에서 10 분 동안 튜브. 그리고 나서 상등액을 4-6 ml의 멸균 USP 등급 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (원액)에 펠렛을 재현 탁 대기음. </li><li> 기생충 가운데 큰 사각형의 네 모서리와 중앙 광장에 기생충의 수를 다음 정착 계산하는 원액 10 μL와 혈구를 넣고 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> 파라 희석100K / 200 μL의 적절한 접종량에 사이트 후 PBS 200 ㎕의 총 부피로 복강 내 (IP) 주입 된 마우스 배일. 참고 :이 절차를 들어, 마우스는 100K 유형 III (CEP) PBS 1X 200 μL 13 tachyzoites에 접종 하였다. 톡소 플라스마의 다른 균주와 마우스를 감염되면 접종의 농도는 독성의 수준을 고려하여 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 2. 관류 및 뇌 수확 주 :이 낭종 피크 번호 마우스의 뇌에서 발견되는 시점을 나타내는 바와 같이이 프로토콜은 이십일일 감염 후의 수 (dpi)에서 수행되었지만, 다른 시점이 사용될 수있다. 17 - 낭종 크기, 개수, 위치 및 유무 마우스 균주, 균주 기생충 타입뿐만 아니라 접종량 7,14를 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 수사관들은 개별적으로 마우스와 Toxoplas에 대한 적절한 접종을 결정해야합니다엄마의 변형은 그 / 그녀는 사용합니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 설치 모든 수술 수확 도구 (그림 1). </li><li> 각 마우스의 경우, 준비하고 얼음에 보관 : 0.9 % 염화 나트륨 (NaCl을) 가득 20ml의 주사기를 + 10 U / ㎖ 헤파린 1X 멸균 USP 등급 PBS (헤파린 / 식염수)에; 20 ML의 주사기는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 가득; 15 ml의 4 % PFA와 섬광 유리 병. 여러 쥐를 들어, 각 관류 솔루션의 전체 신선한 주사기를 그리는 모든 마우스에 필요한 각 솔루션의 전체 양 가득 비커를 준비합니다. </li><li> 200 μL / 케타민 / 크 실라 칵테일의 체중 25g (24 ㎎ / ㎖ 및 4.8 ㎎ / 각각 ml)에 관심이있는 날에 함께 마우스 IP를 마취. 발가락 핀치 반사를 확인하여 마취의 수준에 대한 마우스를 모니터합니다. 마우스가 회사 발가락 핀치에 대한 응답을 보여줍니다 만하면 프로토콜을 계속합니다. 주 : 마취 적절한 레벨에 도달하기 전에 마취로하는 다른 방법은 한 사용될 수있다프로토콜을 진행. </li><li> 적용 대상 거품 플랫폼에서 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 다음 70 % 에탄올 (EtOH로) (그림 2A)와 함께 가슴과 복부를 스프레이 발 사지를 핀입니다. 무균 마우스하에 여러 종이 타월 첨가 관류 액의 오버 플로우를 흡수하는 데 도움이 될 수있다. </li><li> 단지 집게로 흉골 아래 리프트 피부는 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 가슴 (그림 2B)을 노출 다시 피부를 당겨. </li><li> 과정을 칼 모양의 올리고 퉁명스럽게 멀리 다이어프램에서 해부 간을 노출, 횡격막 바로 아래 복부 절개를합니다. 두 절개, 왼쪽에 하나, 다이어프램을 통해 오른쪽 갈비뼈 아래에 하나를 확인합니다. 약 1 / 2-2 / 3의 방식으로 다음 흉강 (그림 2C)를 열고 다시 반사되어 흉곽을 좌우 절개를 확장 할 수 있습니다. 참고 : 관리법은 장기를 잘라하지 않거나 주요 혈관 뒤관류의 품질을 손상 그럴 경우로이 절차를 반지. </li><li> 10 ~ 20 ml의 4 % PFA 다음 10 ~ 20 ml의 헤파린 / 식염수로 transcardially 관류. 참고 : 관류가 제대로 수행 할 경우, 간 (그림 2D)를 황갈색 빨간색에서 켜집니다. 올바르게 수행되지 않으면 혈관 표시 (도 2E)이 될 것이다. </li><li> 복부에 마우스를 뒤집어서 다시 핀 피트는 70 % EtOH로 머리와 목 스프레이. 목의 기지에서 피부를 들어 올려 절개를합니다. 두개골 (그림 2 층)을 노출 피부를 제거합니다. 어깨 레벨 헤드 참살. 부드럽게 뇌를 제거, 두개골을 제거하고, 4 % PFA (그림 2G-H)로 가득 섬광 유리 병에 넣습니다. 참고 : 잘 관류 경우, 뇌가 눈에 보이는 혈관 (그림 2I) 흰색 나타납니다. 뇌 관류 잘되지 않으면 혈관 표시 (도 2J) 될 것이다. </li><li> 불꽃 배치4 ° C에서 4 % PFA 뇌와 기의 유리 병 하룻밤, 빛 덮여. 냉장 1X PBS로 가득 찬 새로운 섬광 유리 병에 비 USP 등급 1X PBS의 뇌와 전송을 씻어. 빛 덮여 4 ° C에서 1X PBS의 뇌를 저장합니다. 노트 : 청소 및 이미징은 최대 한 달 동안 1X PBS에 저장 섹션으로 수행하지만, PFA 고정 역 것이다 PBS에서 장기간 보관으로 몇 일 이내에 뇌가 최적의 이미지 미만으로 이어질 수있는이 부분에 가장 적합한되었습니다 . 자기 형광 증가 흐림는 한 달 이상 1X PBS에 저장 한 후 몇 군데 일부 섹션에서 언급되었다. </li></ol> 3. 뇌 단면 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS에서 뇌를 제거하고 더 정확한 수 있도록 뇌 매트릭스 (그림 3A)에 배치, 심지어 뇌를 잘라냅니다. 존재하는 경우, 소뇌 및 후각 전구를 손질 한 다음 2 ~ 3 개의 섹션으로 coronally 뇌를 잘라. <li> 시아 노 아크릴 레이트와 시편 장착 블록 위에 각각의 뇌 부분을 붙입니다. 지원 뇌 부 (도 3b) 뒤에 5 % 아가 로즈 겔의 소 블록을 부착. 주 : 다른지지기구가 사용될 수 있지만,지지 않고, 요철 단면에 vibratome 원인 뇌 밀어있다. </li><li> 에 vibratome와 두꺼운 섹션 4의 속도와 9의 진폭으로 설정 160 μm의 (영상에 사용되는 목적의 작동 거리)로 조직을 잘라. 주 : 속도 및 진폭의 설정이 특정 시스템에 따라 조정될 수있다, 심지어 부드러운 부분을 얻기 위해 사용된다. 설정이있는 경우올바르지 않은 결과는 단차, 조직 또는 채터 마크의 인열 될 수있다. </li><li> 그들은 1 주일 이내에 삭제하려는 경우 1X PBS 차게 신선한 가득 섬광 유리 병으로 조직 섹션을 수집합니다. 섹션 1 주일 이내에 삭제하지 않을 경우, -20 ° C에서 cryopreservative 솔루션 및 저장 가득 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 넣 섹션. </li></ol> 뇌 조직 섹션 4. 광학 지우기 참고 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 방식 8에서 수정되었습니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS + 2 % 트윈 -20 (GL / PBST)에서 25 %, 50 %, 75 % 및 90 % 부피 / 부피 글리세롤을 준비한다. </li><li> cryopreservative의 경우, 1X PBS로 씻어 내고, 25 % GL / PBST 10ml를 포함하는 섬광 유리 병에 전송, 1X PBS에서 섹션을 제거하거나. 12 시간 동안, 노출 빛에 덮여 4 ° C에서 진탕에 배치 유리 병. </li><li> 모든 섹션이 보에 침몰했는지 확인유리 병의 ttom. 섹션은 다음 12 시간 동안 빛에 노출 적용, 4 ° C에서 진탕에 10 ml의 50 % GL / PBST와 유리 병 및 장소를 채우기 충당하기 위해 충분한 떠나, 25 % GL / PBST를 대기음. 75 % GL / PBST 후 90 % GL / PBST에 대해이 과정을 반복합니다. 최대 청산에 도달하기 위해 24 시간 동안 90 % GL / PBST에 섹션을 남겨주세요. 삭제 절차의 과정 동안 점진적 광 소거 (도 4)를 관찰한다. 참고 : 솔루션 섹션은 유리 병의 바닥에 침몰 직후 변경된 경우이 과정이 신속 할 수있다. 75 % 및 90 %의 솔루션으로, 절은 유리 병의 바닥에 모든 방법을 침몰되지 않지만 중간에 떠. </li></ol> 5. 설치 뇌 조직 섹션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 스페이서를 만들기 위해 5 조각으로 제 1.5 커버 슬립을 잘라. 도 5a에 표시된 점선을 따라 커버 슬립 점수 및 휴식 통치자와 다이아몬드로 만들어진 연필을 사용합니다. 취소 t그는 창을 생성하기 위해 일반 유리 슬라이드에 4 개의 외부 조각을 마련, 조각을 중심하고 올바른 구성 (그림 5B)에서 슬라이드로 스페이서의 조각을 준수하기 위해 솔기에 투명 매니큐어를 브러시. 참고 : 스페이서 슬라이드 및 삭제 섹션을 장착 커버 슬립 사이에 필요한 공간을 만드는 데 사용됩니다. coverslip에 필요한 모든 크기의 창을 만들 수있는 다른 방법으로 절단 될 수있다. 사전 컷 거품 스페이서도 시판되고있다. 매니큐어가 완전히 건조 할 수 있도록하기 위해서는 적어도 하루 전에 설치 섹션에 스페이서 슬라이드를 만드는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 팁 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드로 전송 섹션은 차단. 90 % GL / PBST로 주변 지역을 작성해야합니다. 조심스럽게 확인 모든 거품을 소개 않도록주의하면서 섹션을 통해 커버 슬립을 낮 춥니 다. 초과 GL / PBST는 보풀이없는 닦아 멀리 악인 할 수있다. </li><li> 이미지 GFP + RFP를 포함하는 신경 세포 + <em&gt; 공 초점 현미경 즉시 (그림 7A-B) 저장 한 다음 슬라이드는 평평하고 4 ℃에서 빛 덮여 톡소 포자충 낭종. 참고 : 또한, 인감 완전히 주위의 모든 모서리를 저장하고 나중에 영상화하는 슬라이드. 슬라이드를 밀봉 명확한 매니큐어의 사용은 선택 사항이고 다른 하나는 추가 처리를 위해 나중에 슬라이드에서 섹션을 제거 할 수 있다면 더욱 어렵게 커버 슬립을 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 이미징 주 : 현미경 고해상도 Z-스택을 얻는 능력을 갖고 사용할 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 처음에 10 배에 초점면을 발견 한 후, 20 배 목표로 변경하고 GFP + 세포 내부에있는 낭종을 식별 할 섹션을 통해 스캔 할 수 있습니다. 시야에 대한 관심 (ROI)의 지역 센터입니다. </li><li> 40X 목표로 변경합니다. 있는지 확인하기 위해 전체 투자 수익 (ROI)을 통해 아래로 초점 전체 셀 및 CYST는 볼 수 있습니다. 참고 : 이미지는 40X / 1.30 오일 DIC M27의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. </li><li> 설치된 이미징 소프트웨어를 사용하여, 낭종 셀 전체를 포함 Z 스택을 얻었다. 이미지를 획득하기 위해 보통 사용되는 설정은도 6에 도시되어있다. 참고 : 설정은 각 연구자의 조직 섹션과 현미경의 기능에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 돌기 (64)의 개수를 설정하여 전체 뷰를 구하는 회전 1. 돌기의 수를 설정하여 Z-스택의 최대 투영 화상을 얻는다. 주 : 다른 소프트웨어 패키지가 이용 가능하며 최대 투영을 얻기 위해 사용될 수 있고, 회전뿐만 아니라 Z 스택의 다른 이미지보기. </li><li> 영상 분석 소프트웨어와 이미지를 분석합니다. </li></ol>

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감염된 숙주 세포에서 세포 변화는 HIV, 광견병, 클라미디아 (18, 19)와 같은 다른 세포 생물과 감염 질환의 결과에 연결되어 있음을 감안할 때, 우리는 우리가 CNS 사이에 발생하는 친밀한 상호 작용을 연구 할 수 있도록 해주는 기술을 개발 세포 및 톡소 플라스마를 개최. 여기에 기재된 방법은 만성 감염 뉴런의 효율적인 이미징을 가능하게함으로써 이러한 목표를 달성한다. 이 방법?...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
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Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다. 톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다. 놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) 5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM (7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다. 우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 (8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 11 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 </em&gt; 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하고 숙주 세포 (9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP + 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP + 세포의 수는 10 기생충을 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP + 또한 RFP + 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP + / RFP를 사용할 수 - 뉴런. 감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

톡소 포자충은 인간과 설치류를 포함한 광범위한 호스트 범위와 의무적 인, 세포 내 기생충이다. 모두 인간과 설치류에서, 톡소 플라스마는 뇌의 평생 지속적인 감염을 설정합니다. 이 뇌 감염이 태아 또는 뇌의 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에 대한이 편애 및 지속성 등의 면역 개인, 대부분의 면역 사람들 무증상이지만 파괴적인 신경 학적 질환으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 뇌 - 톡소 상호 작용에 의해 생성 톡소 질병 증상에 중요하다, 그러나 우리는 중추 신경계 (CNS) 및 기생충 세포 간의 세포 또는 분자 상호 작용의 이해가 작은 것은 분명하다. CNS의 마우스 모델에서이 신경 기생충가 지속되는 세포 인 30 년 이상 알려져있다 톡소 플라스마 증,하지만 약간의 정보는 약 사용 가능신경 세포의 일부는 일반적으로 (소마, 수상 돌기, 축색 돌기를) 감염이 세포 관계는 긴장 사이에서 변경하는 경우. 부분에서는 부족은 촬상의 어려움과 이차 전체 감염된 동물로부터 신경 세포를 시각화한다. 이러한 이미지는 통상적으로 직렬 절편 및 전자 현미경 또는 면역 염색 후 공 초점 현미경에 의해 촬상 조직 봉합을 필요로한다. 몇 가지 기술을 조합하여, 여기에 기재된 방법은 면역의 필요없이 입체 시각화 및 개별 만성적 감염 뉴런의 분석을 가능하게 식별하고 낭종이 포함 된 이미지 전체 셀에 두꺼운 부분의 사용 (160 μm의) 사용, 전자 현미경 , 또는 직렬 절편과 바느​​질. 이 기술을 사용하여, 우리는 기생충 감염 및 신경 세포 사이의 관계를 이해하기 시작할 수있다.

도 7은 A와 B가이 새로운 것을 낭종 함유 개의 상이한 160 μm의 두께 부분뿐만 아니라,도 7b에 대한 낭종 간 세포 몸으로부터의 거리의 대표적인 측정. 도면으로부터 GFP + 뉴런을 도시 7 개의 대표 화상을 포함 프로토콜은 그 전체가 감염된 신경 세포의 가시화를 허용.도 7c는이 영상 법으로는 낭종 세포체 (Imaris 7.7) 사이의 거리?...

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K 조회수.  University of Arizona.  이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다. 

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

연구

신경과학

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

면역학 및 감염병학

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Fluorescent Reporter 정량화를 통한 전체 장기 병원체 추적

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

저자 스포트라이트: Unraveling Bacterial Responses to Antibiotics and Immune System in Tissues(조직의 항생제 및 면역 체계에 대한 박테리아 반응 규명)

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염

요약

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만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)