우리는 머리 플레이트 디자인 에밀리 A. 켈리 감사합니다. 우리는 노파에게 NIH 보너스의 지원에 대한 감사 : PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851이 작업이 가능 않았을 텐데 어떤 않고 제프리 Waasdorp 소아 신경과의 기금의 관대한 지원합니다. AKM은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 알프레드 P. 슬로안 재단과 버로우즈 웰컴 기금에서 의생명 과학의 경력 수상으로 후원됩니다. MET는 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다. DFM은 NIH T32 GM07356 및 T32 AI049815에 의해 재정 지원 의료 과학자 훈련 프로그램에 연수생입니다.

1. 이미징을위한 동물 준비 <ol><li> 우리의 실험에서, 우리는 microglia 포함한 mononuclear 세포 lineages에 표현 GFP. 생쥐의 4 가지 변종이 특정 프로젝트의 요구를 충족하는 데 사용할 수있는 성인 CX 3 CR 1 GFP / + 마우스를 사용합니다. </li><li> 동물이 더 이상 통증 자극에 반응하지 후 0.05 밀리그램 / kg 펜타 닐, 5.0 MG / kg Midazolam 및 0.5 밀리그램 / kg Medetomidine 구성된 세 마약 칵테일의 intraperitoneal 주사와 마우스를 마취. TSCW 5 외과 준비, 시작 등 꼬리 핀치로. 수술과 영상 전반에 걸쳐, 우리는 포스트 마취의 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에있는 동물을 유지. 필요한 경우 1, 3 분의 1의 부스터 선량은 마취 칵테일의 원래 복용량은 원래 마취 비행기를 복원 부여하실 수 있습니다. </li><li> 마취 동안 눈을 촉촉한 유지 보호 안과 연고와 동물의 눈을 감아라, 이것은 동물의 깜빡 반사를 표시하지 않습니다. 면도칼을 사용하여 동물의 두피에서 머리카락, 가위, 가위, 또는 화학적 방법을 제거합니다. 10 % povidone - 요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독. 모든 수술 장비 유리 비드 살균기, 또는 70 % 에탄올로 소독과 멸균, autoclaved해야합니다. </li><li> 두개골에 꼬리 4~5밀리미터를 시작하고 눈 앞에 앞으로 발전, 작은 가위를 사용하여 두피의 정중선 절개를합니다. 이 절개가 충분히 피부가 두 광자 이미징 (그림 1) 동안 마우스 머리를 고정하는 데 사용되는 머리 판의 gluing 방해하지 않을 것이 중요합니다. 해부 현미경 thinned으로 지역을 식별합니다. 두개골이 분야에서 덜 안정 및 대형 선박과 meninges을 기본 것은 이미지에 영향을하므로 직접 두개골 봉합 이상있는 관심의 영역을 피하십시오. </li><li> 두개골의 상단에있는 세포막을 건조하고 고급 핀셋 또는 면도날을 사용하여 거리를 긁어 멸균 면봉과 산화철 염화의 10 % 용액 다음 100 % 에탄올을 적용합니다. 불안 정한 헤드 플레이트 첨부의 세포막 결과를 제거하는 실패. </li><li> 머리 접시 아래에있는보기 창의 가장자리 주변 Permabond 910 접착제의 얇은 레이어를 놓습니다. 빛의 압력 (그림 1)와 동물의 두개골에 대한 관심의 영역 접착제로 코팅 머리 접시를 놓습니다. 머리 판에만 두개골의 뼈에 붙어있다 것이 중요합니다. 머리 판과 두개골 사이에 잡힐되는 피부 또는 점막은 채권의 안정성을 감소합니다. 즉시에 주사기 본드 접착제를 사용하여보기 창의 주위 아크릴 레이트의 작은 금액을 적용합니다. 마지막으로, 누출을 방지하기 위해 시청 윈도우의 가장자리에 Loctite 454의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> 동물 홀더 (그림 1) 머리 플레이트 비할 가볍게 포셉 한 쌍의로 탐색하여 절개 범위에서 머리 판의 안정성을 확인합니다. 머리 접시에 상대적으로 두개골에 대한 움직임이 없어야합니다. 아무 누수가 없다 않도록 보는 창에서 호수의 드롭 놓습니다. </li></ol> 2. Thinned 해골 두피 창 준비 <ol><li> 두개골을 벗겨 준비에서 무균 목화 면봉 및 압축 공기의 조합을 사용하여 두개골을 건조. 4000 RPM으로 설정 Microtorque II 훈련에 살균 IRF 007 드릴 비트와 함께 두개골을 우리는 처음에 얇은. 아주 부드럽게, 두개골의 2-2.5 mm 직경 원형 지역을 고르고 ​​시작합니다. 두개골에 거의 평행 광만을 청소 동작을 사용하며, 직접적인 하향 압력을 사용하지 않습니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 드릴링 중지합니다. 드릴링에서 이러한 휴식은 기본 뇌 조직에 더 열을 유발 손상이 없습니다 때문에 두개골 괜찮아 수 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 시추가 진행되면서 moister 해면 뼈 계층 (예 : &quot;diploe&quot;)로의 전환을 확인합니다. 이 레이어에 도달되면, 드릴 여분주의. </li></ol></li><li> 때때로 thinned 영역 살린 배치 및 해부 현미경으로 보면 두개골의 두께를 확인하십시오. 호수가 추가로 방열을 사용합니다. 두개골이 thinned이므로, 작은 vasculature가 표시됩니다. </li><li> microblade은 두개골의 안정성에 대한 더 많은 촉각 피드백을 제공하는 등 생리에 따라 숱이 최종 달성하기 위해 살균 치과 microblade을 사용합니다. 이것은 혼자 드릴보다 훨씬 얇은 준비를 위해 수 있습니다. 우리의 경험에서 최적의 두개골 두께는 10-30 μm의 수 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 얇은 두개골 윈도우를 만들기에있는 처음 몇 시도하는 동안 epifluorescence 여러 번 아래에있는 두개골의 두께를 확인하는 것이 중요합니다. 보이는 microglia과 vasculature의 선명도와 깊이 창 이미지 준비 때만큼 잘 알려주지. </li></ol></li><li> 일단 창이 접착제는 # 0 coverglass WI의 사용자 정의 - 만든 사각형 조각, 준비<html> 창문이 지남에 따라 각 면에 미만 2mm의 크기 일. 1.0 mm 직경의 유리 피펫을 사용하여 thinned 두개골 지역에 cyanoacrylate 접착제의 작은 방울을 배치하고 coverslip의 작은 조각 아래 신중하게 낮은, 다음 접착제를 초과하는 금액을 짜내다로 두개골에 대해 부드럽게 누르십시오. 광학 불투명 될 수 밑에 갇힌 공기가 지역의 원인이 있기 때문에 이것은 유리와 접착제 사이의 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 그 때 건조 투명 남아 있으며, 뼈 및 얇고 반투명 창 아래에있는 두개골을 유지 막 regrowth을 방지하기 때문에 cyanoacrylate 접착제가 사용됩니다. 커버 유리 상단에있는 접착제가있다면, 커버 유리가 자리하고 접착제가 건조되면 신중하게 그것을 제거하는 microblade을 사용합니다. </li><li> 진통제 (예를 들어, Buprenorphine 2 MG / 서브 cutaneously kg)은, 체중 감소, 타액의 분비, piloerection, 호흡 소리, 이동 먹지도 않고 마시지도 않으려는 등 수술 후 즉시 시행과 고통의 흔적에 다시 관리합니다 등등 </li></ol> 3. 두 광자 이미징 <ol><li> 두 광자 이미징을위한 준비에 호수와 TSCW을 차지하고 있으며 epifluorescence에 따라 관심 영역 (그림 2)를 찾습니다. 지역의 이후 이미지를 사용하려면, 사진 카메라를 사용하여 사진을 찍었. </li><li> 사파이어 레이저 920 nm의에 조정된 : 두 광자 이미징을 위해, 우리는 티로 맞춤 제작된 두 개의 광자 현미경 6 사용합니다. 형광은 전체 - 현장 감지 모드와 180분의 580 방사 필터에 photomultiplier 튜브를 사용하여 감지됩니다. 20X 물 침지 렌즈 (NA 0.95) 이미징 세션 전반에 걸쳐 사용됩니다. 목적에 레이저 파워의 최대 출력 50 65 MW 사이에 설정됩니다. </li><li> 대뇌 피질의 레이어에 대한 관심의 영역 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의)을 선택하십시오. 다시 영상을 촉진하기 위하여, 1X, 2X 볼 같은 분야의 사진을, 그리고 3 배 디지털 줌. 혈관 쉽게 후속 영상 세션 동안 볼 같은 분야를 찾는 랜드마크 역할을하실 수 있습니다. 80-90로 3 배, 다중 Z - 스택의 확대에 따라 각 스택 및 0.69 μm의 단계에서 Z - 단계 (최대 시간이 지남에 따라 microglial 형태와 행동의 좋은 샘플링을 가능하게 30 분, 위해 5 분마다 취득 수 있습니다 그림 3). Z - 스택의 인수 사이에, 하나는 TSCW를 통해 호수의 수준뿐만 아니라 마취의 동물의 깊이를 확인한다. </li></ol> 4. HIV - 1 Neurotoxin, 태트의 분사 <ol><li> 첫째, 35 게이지 바늘과 태트 증착을 방지하기 위해 10 μL Microvolume 주사기의 내부 안감을 silanize. 그것은 바늘과 주사기를 모두 채우고 때까지 silanizing 솔루션 (Sigmacote)을 철회. 상온에서 5 분 앉아에 대한 해결책을 허용합니다. 주사기에서 솔루션을 비우기, 플런저를 제거하고 주사기와 바늘이 완전히 건조 수 있습니다. 마지막으로, 탈이온수과 함께 철저하게 주사기와 바늘을 씻으십시오. </li><li> 지름도 작은 드릴 비트를 사용하여 주동이의 또는 두 개의 광자 이미지가 얻은되었습니다 TSCW하는 측면 3mm에 작은 craniotomy 0.5 mm를 수행하고 신중하게 날카로운 팁을 포셉 한 켤레까지 두개골을 고르고 ​​것은의 thinned 레이어를 삭제할 수 있습니다 쉽게 멀리 뼈. 우리는 3 축 micromanipulator과 craniotomy에 바늘 끝을 라이닝 후 장착 Ultramicropump III 주사기 펌프에 의해 제어되는 35 게이지 바늘로 장착되어 10 μL Microvolume의 주사기를 사용하여 그 아래에 900 μm의 700의 깊이에 신중 고급입니다 3 μL 태트 1-72 (또는 다른 프로 염증성 대리인) 또는 생리 (또는 제어 차량) 80 NL / 분 전달 pial 표면. </li></ol> 5. 동물 주택 <ol><li> 동물은 하루에 여러 번 몇 군데있다면, 안과 연고 및 이미징 세션 사이에 불편함이나 두개골 손상을 방지하기 위해 바셀린의 혼합물로 두개골의 열린 영역을 커버. 작은 헤드 플레이트 (그림 1B 참조)에서 지원 다리를 분리하고 쉽게 접근할 음식과 물을 따뜻하게 새장에 동물을 놓으십시오. 모든 동물은 항상 수술 후 단독으로 위치해 수 있습니다. 동물 이미징 세션은 주어진 하루 완료되면 조심스럽게 머리 판 전체를 제거하고 # 6 또는 작은 봉합과 두개골을 통해 다시 피부를 봉합. 다시 실험 일 사이 쉽게 접근할 음식과 물로 단독 동물 집. 모든 스트레스의 흔적, 고통, 또는 감염 매일 동물을 확인합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 수술과 두 광자 영상 (A)와 헤드 플레이트 디자인 (B)에 대한 동물의 안정화. <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. GFP - 라벨 microglia는 epifluorescence와 시각. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. GFP - 라벨 microglia는 TSCW의 주입 후 두 광자 이미징과 시각, 약 50 pial 표면 아래 μm의. TSCW (일 공)의 주입 후 15-30분 데리고 싱글 두 광자 섹션뿐만 아니라, 7 17일 후, microglia가 염증 모욕의 부재에 inactivated 남아있는 동안 창문을 확실히 유지 것을 보여줍니다. Z - 투영 6 촬영한 24 시간 활성화된 microglia의 에이즈 neurotoxin 문신 전시 인상 morphologic 변경 후 주사. 스케일 바 : 10 μm의.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

HIV - 1 관련 neurocognitive의 결손 (수동)에 대한 실제 기판은 아마도 HIV - 1 감염 mononuclear phagocytes에서 출시된 프로 염증 중재자에 의한 시냅스 아키텍처의 파괴는 것을 강력히 주장하고있다. Microglial 활성화, multinucleated 거대한 세포, 그리고 astrocytic 비대로 인한 gliosis은 CNS 7 HIV - 1 감염과 염증의 특이 현상이 특징으로 간주됩니다. 반면, premortem neurologic 질환의 심각도는 시냅스 복잡 손실뿐만 아니라 CNS 8,9,10,11에서 대식 세포의 부담과 상관되었습니다. 그러나, microglia, 주변 침투 macrophages, 그리고 손으로 환자의 뉴런 사이의 역동적인 상호 작용은 단순히 기존의 immunocytochemical 연구에서 얻은 종래의 고정 처리를 사용하여 모델 수 없습니다. 우리 연구소의 최근 연구 주변 및 중앙 mononuclear 세포와 뉴런 사이의 이러한 상호 작용의 적어도 일부가 뇌 실질 조직 (류, 마커, 트렘블리로 HIV - 1 단백질 태트 1-72의 stereotactic 주사로 부분 모델 수있는 것을 제안했습니다 치, 그리고 Gelbard, 발표되지 않은 데이터). 따라서 neuroAIDS에 대해 다루기 쉬운 작은 동물 모델에서 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia과 뉴런 사이의 상호 작용을 검토하는 생체내 두 광자 이미징에 적용하기로 결정했다. 오픈 두개골 또는 thinned - 두개골 준비 시간이 짧은 기간 (시간)에 대한 대뇌 피질의 건축의 단일 심사, artifactually 인해의 수술 조작에 microglia / 대식 세포를 활성화하지 않고 이러한 준비를 사용할 수 없습니다 아급성 이벤트의 시간 코스에 관심이 조사 여유가 있지만 calvarial 창. 여기 gluing TSCW의 재생에서 두개관을 방지뿐만 아니라 ≥ 3 주간 반투명을 유지 thinned 두개골 영역 유리 coverslip의 작은 조각하여 이러한 한계를 우회의 간단한 방법을 보여줍니다. 우리는 더이 기술이 우리 (CX 3 CR 1 / GFP에 대한 heterozygous 생쥐의 피질에있는 HIV 태트 1-72의 stereotactic 분사에 대한 응답으로 뇌성 microvasculature뿐만 아니라 두뇌 주자 microglia를 입력 주변 monocytes의 행동을 관찰 할 수 있습니다는 것을 보여준다 mononuclear 혈통의 세포를 식별). 이 기술은 쉽게 다른 유전 배경을 가진 생쥐를 사용하여 적용할 수 있습니다, 예를 들어, 우리는 정기적으로 heterozygous CX 3 CR 1 / GFP를 사용하여 X 뜻 - 1 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia 및 뉴런 간의 상호 작용을 조사하기 위해 YFP 12 쥐 손에 관련 neuroinflammation의 생체내 모델 인치 우리 TSCW 준비는 조사관은 주변과 동물 실험 반복 치료 전후에 몇 군데 수있는 주간의 기간, 이상 발생할 수 있습니다 CNS 사이 세포 세포의 상호 작용을 공부하실 수 있습니다. 따라서, 각 동물 자체 제어로 검색할 수 있습니다. 이 TSCW 모델에 대한 하나 주의해야 할 점은 조사에서 대상 세포 중 유전자 향상된 형광 단백질 (eXFP)를 표현하거나 두개 관의 기계적 위반하지 않고 형광 염색이 표시 설계해야 할 것입니다, 그 eXFP 표현은 충분히 강력한해야합니다 셀룰러 아키텍처 주 기간 동안 반복 이미징 세션 이후 시각 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Fentanyl Citrate</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam hydrochloride</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pads</td><td>Beyond Bodi Heat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine 10% solution</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferric chloride 10% solution</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cyanoacrylate 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtorque II handpiece kit</td><td>Pearson Assessments</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>IRF 007 drill bits</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Norland bendable microblade full radius</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>The Original Superglue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 glass coverslip</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Microvolume syringe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>35 gauge NanoFil needle</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube </td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

전통적으로 신경 과학에서 생체내에 murine 중추 신경계의 두 광자 영상도 오픈 두개골 1,2 또는 thinned - 두개골 3 준비의 사용을 참여했다. 오픈 두개골 기술은 다용도로 쓰인다하는 동안 그것이 침략하고 microglial 활성화를 일으킬 수 있기 때문에, 그것은 microglia 공부를위한 최적되지 않습니다. thinned - 두개골 접근 법으로서에도 불구하고, 만성 이미징에 필요한 두개골 다시 밝은 반복하면 조직 손상과 microglial 활성화의 위험을 증가 및 이미징 세션의 제한된 수의를 허용합니다. 여기서 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 오랜 시간 동안 생체내에 murine microglia을 감시하는 만성 박막 해골 창 방법을 제시한다. 우리는 간헐적인 관찰의 세 주 과정을 통해 투명 남아 apposed 유리 coverslip와 안정, 접근, thinned - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 TSCW 준비가 훨씬 더 immunologically 불활성 숱이 오픈 craniotomy 또는 반복 두개골보다 microglial 활성화와 관련되고 주 기간 동안 이미징 세션의 임의의 숫자 수 있습니다. 우리는 pial 표면 아래 ≤ 150 μm의 향상된 녹색 형광 단백질과 microglia을 시각화하는 CX 3 CR 1 GFP / + 생쥐 4 TSCW을 준비합니다. 우리는 또한 이러한 준비가 내구성이 microgliosis을 유도하는 능력이 TSCW에 인접 태트 HIV - 1 neurotoxic 단백질의 stereotactic 뇌 주사와 함께 사용할 수 보여줍니다. 따라서,이 방법은 HIV 관련 Neurocognitive 장애 (수동)과 neuroinflammatory 구성 요소와 다른 neurodegenerative 질병 모델로 살아있는 두뇌에 시간이 지남에 따라 microglial 형태학 및 운동성 변화를 조사를 위해 매우 유용합니다.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 시간, 일 또는 transcranial 두 광자 현미경을 사용하여 주 동안. 우리는 HIV - 1 단백질 규제 태트의 인접한 stereotactic 분사에 의해 활성화될 수있는 정지 microglia의 간헐적인 관찰을 허용 thinned - 해골 창을 준비하는 방법을 보여줍니다.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.6K 조회수.  University of Rochester. 우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을 설명 생체내에 시간, 일 또는 transcranial 두 광자 현미경을 사용하여 주 동안. 우리는 HIV - 1 단백질 규제 태트의 인접한 stereotactic 분사에 의해 활성화될 수있는 정지 microglia의 간헐적인 관찰을 허용 thinned - 해골 창을 준비하는 방법을 보여줍니다.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

연구

신경과학

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

의학

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

면역학 및 감염병학

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Two-Photon Microscopy for Studying Microglial Process Attraction Toward a Compound in a Mouse Brain Slice

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58788/two-photon-imaging-microglial-processes-attraction-toward-atp-or'>Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices.&#160;J. Vis. Exp. (2019)</a>This video demonstrates the use of two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward an injected compound in brain slices. It provides an overview of preparing mouse brain slices, injecting a chemoattractant test compound, and imaging fluorescently labeled microglia to visualize their responses.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징

요약

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