This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

펩타이드 배열 1. 준비 <ol><li> 펩타이드 시퀀스의 프로그래밍 <ol><li> MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다. 펩타이드 1 : TARKSTGGKA </li><li> 정의 된 기판의 인식에 필요한 중요한 아미노산을 화면에 특정 명령 (.replace, A)와 알라닌 또는 아르기닌 도보 라이브러리를 생성합니다. 다음 예에서 예를 들어 첫 번째 라인은 야생형 서열이고 두번째 행에서 각 펩타이드의 아미노산이 알라닌으로 순차적으로 변경된다. , 교체 TARKSTG -ARKSTG T- -RKSTG 맞대기 -KSTG 하는 표적 -STG TARK- -TG TARKS- -G TARKST- </li><li> 유사한 명령 (.replace의 R을 사용합니다.모든 천연 가능한 아미노산 잔기 (결국 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 생략 1.1.2에 기재된 바와 같이 이들 잔기 산화하는 경향이 때로는 낮은 합성 수율 때문에), N 등)를 교체 합의 판정 펩타이드 어레이를 합성 효소에 대한 기질 서열 모티브. 참고 :도 4a에 도시 된 바와 같이, 횡축은 소정의 단백질 서열을 나타내고, 세로축은 명령 선택된 아미노산을 나타낸다. 1.1.2에 도시 된 순서와 유사하게, 종축은 아라 순차적도 첫번째 행에 지정된 시퀀스의 각 위치를 대체한다는 것을 의미한다. 4A. 마찬가지로 순차적 아르기닌 등의 아미노산과 다른 상기 제 2 행에서 각 아미노산을 대체한다. 전체 어레이 펩티드 라이브러리는 체계적 번째의 각각 구비 펩티드 기질 서열 각 잔기를 대체함으로써 합성다른 예를 자연스럽게 사용할 아미노산 잔기, 이것은 주어진 시퀀스의 각 위치에서 각각의 잔기의 영향을 이해하는데 도움이 될 것이다. </li><li> 다르게는, 공지 또는 예측 된 펩티드 기질의 메틸화 용이 양성 및 음성 메틸화 컨트롤과 함께 PKMT의 표적 펩타이드 (메틸화에 공지되거나 메틸화이어야 공지 즉 펩티드) 펩티드 라이브러리를 합성 검증 될 수있다. 수동 프로그래밍에 의해 다음과 같이 대상 라이신의 메틸화를 확인하는 알라닌 추정 대상 라이신을 교환하여 펩타이드를 합성. 야생 형 펩타이드 : STGG K PRQFL 돌연변이 펩타이드 : STGG PRQFL 참고 :이 소프트웨어는 또한 상호 작용에 필요한 중요한 아미노산을지도 할 수있는 시퀀스의 원하는 프레임 시프트와 에피토프 매핑 같은 다양한 라이브러리를 만들 수있는 고유의 스크립트를 가지고있다. </li></ol></li><li> 멤브레인의 제조, 아미노산D 시약 <ol><li> 10 분 동안 DMF (N, N 디메틸 포름 아미드)의 SPOT 막 사전 팽창 한 후 기포 또는 주름없이 SPOT 합성 프레임에 젖은 막 배치합니다. </li><li> 막 100 % 에탄올로 3 회 세척 할 것. 합성 프로그램을 시작하기 전에 적어도 10 분 동안 완전히 막을 건조. </li><li> 이와 병행하여, 갓 NMP에 용해시킴으로써 이들을 시판의 Fmoc- 보호 된 아미노산의 농도는 0.5 M 작업을 준비하고, 표 1에 설명 된대로 활성제와 같은 염기를 준비한다. </li><li> SPOT 신디사이저의 모든 폐액 용기가 비워하고 있는지 확인하고, DMF, 에탄올, 피 페리 딘과 용매 저수지 리필. 참고 : 이제 기계는 합성을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 아미노산의이 보인다 <ol><li> 광고가 들어오는 아미노산 카르복시기를 활성화 멤브레인 자유 아미노기와 아미드 결합을 생성하려면딩 활성제 (N, N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드) 및 아미노산 유도체에 염기 용액 (하이드 록시 에틸 시아 노 아세테이트). </li><li> 프로그램 가능한 로봇을 이용한 PEG 아미노 관능 막 활성화 아미노산 원하는 볼륨 스팟. 주 : 이에 따라, 아미노산의 C 말단이 멤브레인의 아미노기에 결합된다. </li><li> 먼저 활성화 아미노산의 더 나은 커플 링을 보장하기 위해이 단계를 세 번 반복합니다. 비결 아미노산을 제거하는 DMF로 세척 한 다음 20 분 동안 막을 부화. </li></ol></li><li> 비 자리 분야에 무료 공간의 차단 주 : 막의 아미노기 모든 펩티드의 제 C 말단 아미노산의 커플 링 후 기미와 같은 스폿 영역 내에 아미노기의 일부 사이의 아미노기는 아미노산과 결합을 형성하지 않는다. <ol><li> 캐 용액으로 배양하여 이러한 자유 아미노기를 차단 (DMF 중 20 % 아세트산 무수물)5 분. 주 :이 막 대신 성장 펩티드 사슬과 상기 사이클로 아미노산의 커플 링을 방지한다. </li></ol></li><li> Fmoc 등 그룹의 제거 <ol><li> 블로킹 후, DMF로 4 회 세척 막을 다음의 Fmoc- 보호 그룹을 제거하기 위해 20 분 동안 DMF 20 % 피 페리 딘과 함께 배양한다. 참고 :이 단계는 아미노 보호 Fmoc 등 그룹의 제거에 이르게 그것은 탈 보호라고합니다. </li><li> 그 후, 에탄올로 두 번 DMF와 두 번 막 세척하고 건조 할 수 있습니다. 참고 : 이제 막 다음 아미노산의 결합에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 체인 신장 주 : 각 아미노산의 첨가주기라고한다. 이 외에 제 아미노산의 결합에서, 사이클은 결합 아미노산 및 Fmoc 기의 탈 보호와 함께 시작되고 그것은 증가 PEP의 아미노기 들어오는 아미노산의 활성화 된 카르복실기의 결합에 의해 이어진다조수 체인. <ol><li> 원하는 펩타이드 길이를 얻을 때까지 반복 1.3 및 1.5 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 염색 참고 : 최종주기 후, 펩타이드 배열이 펩타이드의 합성에 성공을 확인하는 브로 모 페놀 블루로 염색된다. 브로 모 페놀 블루는 펩티드의 자유 아미노기와 결합한다. 펩타이드 반점은 염색 후 밝은 파란색 색상을 표시하지만, 반점의 강도는 펩타이드 서열에 따라 달라집니다. 이 얼룩은 펩티드를 얼룩하지 않기 때문에 피 페리 딘 브로 모 페놀 블루의 존재, 피 페리 딘의 완전한 제거의 확인을 할 수 있습니다. 또한, 이것은 또한 나중에 사용할 펩티드 배열을 표시 돕는다. <ol><li> 마지막 합성 사이클 기의 Fmoc- 탈 보호 한 후, DMF, 100 % 에탄올로 막 세척 하였다. 완전히 청색으로 변할 때까지 그 다음, 5 분 이상 동안 브로 모 페놀 블루 (DMF 0.02 % 브로 모 페놀 블루)과 멤브레인을 치료. </li><li> 이후, DMF 및 ETH으로 막을 세척anol 10 분 동안 건조 하였다. 이제 신디사이저에서 막 꺼내 수동 사이드 체인 탈 보호 (1.8 절)을 수행합니다. 필요한 경우, 펩티드 합성 (도. 2)의 결과를 문서화하기 막을 사진. </li></ol></li><li> 사이드 체인 탈 보호 <ol><li> 측쇄 보호 그룹 및 소제 시약 (2.5 %의 물과 2.5 % 트리 이소 프로필 실란)에서 아미노산의 측쇄를 보호를 절단하기 위해 95 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)로 이루어지는 측쇄 탈 보호 혼합물의 20 ~ 25 ml로 멤브레인 치료 이 단계에서 수정. 완전히 밀폐 된 화학 물질 상자에서 막 다루고 있는지, 부드럽게 흔들어 섞으면 서 1 ~ 2 시간 동안 그것을 부화 탈 보호 혼합물의 충분한 볼륨을 가져 가라. </li><li> 2 분마다 DCM (디클로로 메탄)의 20 ~ 25 mL로 막 여섯 번 씻고 마지막으로 두 번 100 % 에탄올로 밤새 데시 케이 터 (실리카겔). 참고 : 지금멤브레인은 실험에 사용될 수있다. 펩티드 합성의 배열 방식은도 1에 제공된다. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 및 정제 <ol><li> GST의 용해 등 PKMTs의 단백질 발현 <ol><li> 표준 기술을 사용하여, GST 융합 단백질로서 표현 된 전체 길이 또는 PKMT (유전자 pGEX-6P2 등) 세균성 발현 벡터에의 촉매 도메인을 코딩하는 유전자를 복제. </li><li> BL21 또는 BL21 코돈 플러스 E.에 삽입 원하는 PKMT와 벡터로 이동 열 충격 방법 또는 다른 방법에 의해 대장균 세포. </li><li> 식 당일 루리아 - 베르 타니 (LB) 미디어 30㎖를 함께 예비 배양을 준비하고 연속 진탕 7-8 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 다음에, LB 미디어 L 함유 한 2 L 플라스크에 큰 배플 예비 배양 10 ㎖ 옮기고 37 ℃에서 부화 문화 도달 할 때까지 연속 진탕 배양기에서 ° C600 nm에서 광학 밀도 정의 ES. 주 : 이것은 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있지만, 우리는 일상적으로 약 0.8의 OD를 600 ㎚에서 유도한다. 유도 온도가 개별적으로 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있고, 어떤 단백질은 식 (22)에서 잘 보여 ° C 이상 온도에서 몇 가지. </li><li> 다음 이소 프로필 - 베타 - D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 1 mm의 유도, 15 분 동안 온도를 유도하고 세포 시프트가 유도 배양 온도에서 10-12 시간 동안 성장하는 것을 허용한다. </li><li> 이후 15 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확하고 마지막으로 추가의 사용을 위해 -20 ℃에서 STE 완충액 (10 mM 트리스 pH가 8.0, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 및 저장소 30 ml로 펠렛을 세척 하였다. </li></ol></li><li> 단백질 정제 <ol><li> 세포 펠렛을 해동하고 초음파 처리 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤)의 30 ㎖에 재현 탁하고 초음파 처리에 의해 붕괴. 참고 :이 버퍼 Needs 결국 각각의 단백질을 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간 동안 22,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리, 나중에 상등액을 수집하여 글루타티온 세파 로즈 4B 수지의 600 μl를 함유하는 컬럼을 통해 통과한다. </li><li> 50 초음파 버퍼 ㎖의 높은 소금 버퍼 (7.5 50 mM 트리스 산도, 500 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT 5 % 글리세롤) 비특이적 결합 단백질을 제거하는 100 ㎖와 다음에 열을 씻으십시오. 40 mM의 글루타치온을 함유하는 높은 염 완충액 5 ml로 결합 단백질을 용출시켰다. </li><li> 낮은 글리세롤 (20 mM 트리스의 pH 7.4, 100 mM의 KCl을, 0.5 mM의 DTT, 10 % 글리세롤)의 pH 7.4을 2 시간 이상하는 20 mM 트리스, 100 mM의 KCl을, 0.5 mm의 투석 버퍼의 2 L에 용출 된 단백질을 투석 DTT 70 % 글리세롤 8 시간 또는 하룻​​밤. 모든 정화 버퍼가 4 ° C에 있는지 확인하고 단백질 변성을 방지하기 위해 추운 방에서 단백질 정제를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 3. 펩타이드 배열 메틸화 <ol><li> 사전 incu펩타이드 배열의 bation <ol><li> 효소와 고가의 방사능 표지 AdoMet의 낭비를 방지하기 위해 적절한 크기의 상자 또는 비닐 봉투에 하나 펩타이드 배열 메틸화를 수행합니다. 10 분 동안 효소없이 각각의 메틸화 버퍼를 포함하는 밀봉 된 비닐 봉지에 펩티드 배열 멤브레인과 표지 [메틸 3H] -AdoMet 사전 품어. 예 전체 특이성 프로파일 펩타이드 어레이 메틸화 완충액 8ml의 사용을위한 버퍼의 부피는, 어레이의 크기에 의존한다. 각 효소의 양 및 AdoMet의 농도를 최적화 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 펩타이드 배열의 메틸화 <ol><li> 사전 배양 버퍼를 취소하고 각각의 PKMT를 포함 메틸화 버퍼의 8 ml의에서 막 부화 및 표시 [메틸 3H] -AdoMet 1 시간 2를위한. 주 : 메틸화 반응에 필요한 효소의 양이 특정 PKMT의 활성에 의존 우리 스크리닝 실험은 50 nM의 효소 지느러미 개시 전형적Al 농도. </li></ol></li><li> 펩타이드 배열의 세척 <ol><li> 이후 방사성 폐기물 컨테이너 메틸화 버퍼를 폐기하고 결합 된 단백질을 제거하기 위해 5 분 동안 100 mM의 중탄산 암모늄 및 1 % SDS를 함유하는 완충액 20 ml로 5 회 펩타이드 어레이를 세척 하였다. 방사성 폐기물 용기의 세척 버퍼를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 방사성 신호의 검출 <ol><li> 세척 후 증폭 용액 (NAMP100V) 10ml에 5 분 동안 막을 배양한다. </li><li> 그런 다음, 유기 용매에 대한 방사성 폐기물 용기로 증폭 솔루션을 폐기 플라스틱 가방에 펩타이드 배열을 봉인하고 오토 라디오 카세트에 넣어. </li><li> 어두운 방에 펩타이드 배열의자가 방사선 필름을 놓습니다. 신중하게 카세트를 닫고에 노출 -80 필요한 시간 C를 °. 그 다음, 결과를 분석하기 위해 필름을 개발한다. 다른 expositio와 시대의 이미지 몇 캡처n 번 강력하게 메틸화 펩타이드 기질의 포화를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 처리 및 분석 <ol><li> 스팟 강렬의 농도계 분석 <ol><li> 기존의 스캐너에 필름을 스캔 농도계에 의해 현물 강도를 분석 할 수 있습니다. (프리웨어)이 사용 ImageJ에 또는 상용 프로그램을 수행합니다. 참고 : 우리는이 작업을 위해 Phoretix 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 정규화 및 다른 점막의 결과의 평균화 <ol><li> 중으로 적어도 펩타이드 어레이 메틸화 실험을. 1.0과 같은 기준 기판에 배경 차감 및 활성을 설정하여 각 실험에 대한 강도를 정규화 스캔. 각 지점의 데이터를 평균 그들에게로 평균값과 표준 편차를보고합니다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 및 디스플레이 <ol><li> 상대 활성을 나타내도록 그레이 스케일 또는 컬러 방식을 사용하여 2 차원의 데이터를 플롯. 이 위스콘신 수행일 Excel 또는 Sigmaplot은 다음과 같이. 또한, 데이터의 품질을 분석하는 실험을 반복의 표준 편차의 분포의 플롯을 준비한다. </li><li> 정량적 비교 기질 펩티드에서 각 잔기의 인식의 정확도를 표시하려면, 판정 계수 D (16, 17)에 의해 위치 (x)에서의 각 아미노산에 대한 I PKMT의 상대적인 우선 순위를 계산한다 : D의 X, I = &lt;V의 J ≠ 전&gt; / V I - 1 V (I)이 위치 (x)와 AT 아미노산 I 운반 펩타이드 변이체의 메틸화 비율 임 &lt;브이 j는 ≠ 난&gt; 포함한 위치 x에서 다른 아미노산 J ≠ I 들고 19 ​​개의 펩티드의 메틸화의 평균 속도 (인 야생형 서열). 참고 :이에 의해 정의 된 차별 요소는 배경 수준에 따라 달라집니다. 하나만 잔류 3 %의 배경, 차별 특정 위치에서 승인되면32.3의 인자를 얻을 수있다. 위치에서 어떤 환경 설정은 0의 차별 요인을 초래하지 않습니다. </li></ol></li></ol>

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Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

여기에 설명 된대로 합성 SPOT 단백질 - 단백질 상호 작용 부위를 맵핑하고 수정 펩티드 효소 기질 인식을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. SPOT 방법에 의해 합성 된 펩타이드가이 각 인스턴스에서 확인하기 어려운 90 % 이상의 순도 21 것으로보고되었지만 때문에 SPOT 합성은 아직 특정 단점을 갖는다. 따라서, 결과는 예를 이용한 단백질 또는 도메인에 대한 표준 방법에 의해 합성, 정제 된 ?...

지난 20 년 동안, 여러 보고서는 세포 개발 및 암 등 여러 질병,하지만 최근에 단백질 리신 메틸화는 또 다른 중요한 PTM로 떠오르고있다에서 번역 후 변형 (PTM)의 중요성을 보여 주었다. 초기 히스톤 메틸화 라이신 필수적인 염색질 마크 것으로 확인되었지만, 이후의 작업은 여러 비 - 히스톤 단백질 1-4 리신 메틸화 하였다. 리신 잔기의 ε - 아미노기에 S-L 아데노 실 메티오닌의 메틸 기의 순차적 인 전송은 인간 게놈에서 60 개 이상의 단백질을 포함 리신 단백질 Methyltransferases (PKMTs)라는 효소 패밀리에 의하여 촉매된다. PKMTs 처음 특정 라이신 잔기 메틸화 나중에보고들은 또한 비 - 히스톤 단백질 5 메틸화 수 있다고 입증 히스톤 변형 효소로 발견되었다. 지금까지 약 5,000 라이신 메틸화 다른 단백질 6에 확인 된 </s최대&gt;하지만, 이러한 수정에 대한 책임이있는 효소는 종종 식별되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 가장 PKMTs의 특이성이 광범위하게 연구되어 있지 않은 점이다. 따라서, 반복적으로 PKMTs 신규 기질이 발견되어 발생한다. PKMTs의 기질 특이성의 상세한 지식의 결여는 그들의 생물학적 기능 및 역할에 대한 이해를 방해한다. 상세 PKMT의 특이성을 연구하는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 다를 많은 펩티드 기질의 메틸화 속도는 측정해야 이상적 펩타이드 어레이를 사용하여 수행되는, 비교. 얻어진 특이성 프로파일에 기초하여, 잠재적 PKMTs 기판은 더 연구 될 수있는 식별 될 수있다. 펩타이드 어레이 널리 항체, 펩티드 변형 효소 단백질 - 단백질 상호 작용 부위 (항체 - 항원, 수용체 - 리간드) 7-9의 맵핑의 생화학 적 분석을위한 도구를 사용한다. 펩타이드 수백는 SUC에 필요한시간 응용 프로그램. 다른 방법들이 매우 일반적으로 사용되는 수지를 합성 펩타이드 중, 펩티드 합성에 사용할 수 있지만, 스루풋에 한계를 가지고 있으며, 이것은 상대적으로 고가이다. 이러한 문제는 프랭크와 동료 (10)에 의해 SPOT 합성 방법의 도입으로 해결이되었습니다. SPOT 합성법 병렬 수백 펩티드의 합성이 가능하며 평균 그것은 합성 수지에 비해 저렴하다. 셀룰로오스 막에 합성 된 펩타이드는 막에서 절단 및 솔루션 분석에서 무료 펩타이드로 사용 또는 펩티드 마이크로 어레이 10-13을 준비 할 수있는 다양한 응용 프로그램 또는 펩티드 직접 사용할 수 있습니다. SPOT 합성은 고체 지지체로서 셀룰로오스 멤브레인을 사용하며, 표준의 Fmoc- 화학을 채용 10-13 고상 펩티드 합성의 변형이다. 따라서, 펩타이드의 합성은 C 말단에서 시작 향해 진행리보솜에서 합성 생물학적 대조적 N 말단. 셀룰로오스 막은 먼저 활성화 아미노산 (도. 1)의 부착을 위해 관능 화된다. SPOT 방법은 자동 피펫 팅 장치를 이용하여 막에 정의 명소 용매 액적 활성 아미노산의 순차 전달에 기초한다. 액체의 방울은 나중에 펩타이드 합성 화학 반응을위한 오픈 반응기 역할을하는 원형 젖은 자리를 형성하는 다공성 막에 분배된다. 스폿 사이즈가 분배 용적과 멤브레인의 흡수력에 의해 결정되고, 예컨대 스폿의 배수로는 어레이로 배열된다. 합성 스케일 스폿 사이즈와 막의 적재량과 상관을 갖게 할 수있다. 스폿 및 배열 밀도 사이의 거리는 스팟의 크기를 변경함으로써 관리된다. 셀룰로오스 멤브레인 펩티드 합성 고상 같은 여러 가지 장점을 가지고, 그것은 Chemic의 행 저렴 관대수용액에서 안정하고 취급이 용이 한 펩타이드 합성에 사용 ALS. 또한, 친수성 ​​성질은 여러 생물학적 분석 시스템들에도 적합하다. SPOT 합성은 수동으로 수행하거나 필요한 펩티드의 수에 따라 (펩티드에 대한 1000) 자동화 될 수있다. Intavis (쾰른, 독일)에서 완전 자동화 SPOT 합성기는 우리의 응용 프로그램에 사용됩니다. 그것은 다른 양의 서로 다른 길이의 펩티드의 합성을 허용합니다. 또한 단계적 합성 (14,15)에 의해 제조 될 수있는 선형 펩티드는 규칙적 42 아미노산 펩타이드의 첨가에, 15 ~ 20 개의 아미노산 길이로 합성된다. 그러나, 아미노산의 수를 증가시키는 것은 펩티드의 품질에 영향을 전체 결합 수율의 감소를 이끈다. 이 때문에 스폿 당 펩티드의 낮은 양 때문에, 제품은 종종 정제하기 어려운 개별 펩티드의 품질을 용이하게 평가할 수 없다. 따라서 결과의 SPOT pept로부터 얻어진IDE 어레이 정제 펩티드 합성 또는 원하는 펩티드 서열을 함유하는 단백질을 합성 기준에 따라 분석 될 수있는보다 큰 규모의 표준 방법에 의해 합성 된 펩타이드 중 하나를 확인해야한다. 아직도, 우리는 매우 신뢰할 수 SPOT 합성을 발견하고 재현 할 수 일반적으로 발생합니다. SPOT 합성은 펩티드 전과 또한 최종 측쇄 보호 그룹의 절단하고, 이후에 변형 될 수 있도록, 아미노산, 또한 합성에 사용할 수있는 몇 가지 시판 변성 아미노산 proteinogenic에만 제한되지 않으며 또한 혼입 허용 인산화 메틸화 또는 아세틸 아미노산 (11). SPOT의 고정화 방법으로 합성 펩티드 라이브러리는 직접 많은 생물학적 및 생화학 적 분석에 사용될 수있다. 우리 PKMTs의 기질 특이성을 조사하기 위해 300-400 펩타이드를 포함하는 펩티드 배열을 채용. 효소 후 변형의 경우양이온, 펩티드 배열은 각 PKMT 함께 인큐베이션하고 적절한 완충액 [메틸 3 H] -AdoMet 표지. 각 기판의 메틸화는 오토 라디오 그래피를 통해 펩티드 기질에 AdoMet에서 방사성 표지 된 메틸기의 전사 효소 (도이. 3)에 따라 분석한다. 이 절차에 의해, 펩티드 배열은 동시에 두 펩티드 기질의 메틸화 연구를 허용한다. 이 방법의 한가지 중요한 이점은 모든 펩티드 메틸화 반응 속도의 선형 단계에서, 각각의 펩티드의 상대적인 메틸화가 해리 상수 (K 고양이 / K로 나눈 촉매 속도 상수에 비례 같은 것을, 대회에서 메틸화된다는 것이다 각 펩티드 기질에 대한 효소의 D). 따라서, 각각의 스폿에 혼입 된 방사능의 양을 직접 향해 특정 펩티드의 효소 활성과 관련된다. 사용펩타이드 어레이 메틸화 실험의 결과는, PKMT의 특이성 프로파일은 예견 할 수있는이 새로운 기판에 정의하고 기초 할 수있다. 펩타이드 어레이 펩타이드 수준에서 신규 기판의 메틸화 신속하고 비용 효율적 검증을 허용한다. 이를 위해, 어레이는 표적 부위에서의 라이신 대신 아라 펩타이드를 함유하는 개질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 펩티드와 함께 예측 된 신규 한 기판을 포함하는 것이 제조된다. 마지막으로, 신규 한 기판은 돌연변이 체와 함께 단백질되는 대상의 Ala가 라이신으로 변경되고, 메틸화 단백질 레벨에서 확인할 수있는 바와 같이 제조 될 수있다. 결과에 따라,이 후, 새롭게 기재된 단백질 기질의 메틸화의 잠재적 역할을 어드레싱 생물학적 연구에 의해 이어진다.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

라이신 메틸화는 신흥 포스트 번역 수정하고이 세포 개발 및 많은 질병에서 중요한 역할을 담당 곳에는 여러 히스톤과 비 히스톤 단백질에 발견되었습니다. 약 5,000 라이신 메틸화 단백질 라이신 methyltransferases의 몇 수십 설정되어 다른 단백질에 확인되었다. 이제이 하나 또는 두 개의 기판이 효소의 여러 가지에 대해 확인 된 그러나까지, 각 PKMT 여러 단백질의 메틸하는 것이 좋습니다. 이 문제에 접근하기 위해, 우리가 도입 펩타이드 어레이 기반의 기질 특이성은 PKMTs 분석. 펩타이드 배열은 서로 다른 시퀀스가​​ 여러 기판의 메틸화가 하나의 어레이 테스트 할 수 있기 때문에 PKMTs의 특이성을 특성화 할 수있는 강력한 도구입니다. 우리는 Intavis SPOT 신디사이저를 사용하여 셀룰로오스 막에 펩타이드 배열을 합성 및 다양한 PKMTs의 특이성을 분석 하였다. 이들 효소의 여러 위해, 결과에 기초하여, 신규 Substrates를 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, 펩타이드 어레이를 사용함으로써 NSD1 위해, 우리는 H4의 K44 대신보고를 H4K20의 메틸과 더불어 H1.5K168은 이미 공지 H3K36 위에 매우 바람직한 기판 인 것으로 나타났다. 따라서, 펩타이드 배열은 생화학 PKMTs의 특성을 할 수있는 강력한 도구입니다.

이 방법에 의해 펩티드 5,16-19 어레이 성공적 생화학 PKMTs의 특이성을 특성화하는 데 사용하고, PKMT 여러 신규 한 히스톤 및 비 히스톤 기질의 동정을 행 하였다. PKMT (또는 효소)의 올바른 기판 스펙트럼을 정의하는 분자 메커니즘과 세포 기능의 이해를 향한 중요한 단계입니다. 펩티드 SPOT 어레이 메틸화 방법의 적용 예로서, 우리는 (19)의 NSD1 PKMT 특이성 분석 ?...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K 조회수.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

연구

생화학

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

면역학 및 감염병학

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

생물학

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

신경과학

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...