Name: quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. 세포 배양 <ol><li> 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함). 주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오. </li><li> 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO 2 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다. <ol><li> 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어. </li><li> AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복. </li><li> 개별적으로 60 분 동안 자외선으로 살균 다음에 생물 안전 캐비닛의 실험실 블로 팅 종이에 그들을 밖으로 확산으로 된 커버를 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 35mm 세포 배양 접시에 2-4 건조 된 커버를 놓습니다. 세포 배양 물에서 25 μg의 PBS / ㎖의 농도로 엔지니어링 중합체 (1 ㎎ / ㎖의 스톡 농도) 등 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 용액을 희석. <ol><li> 각 커버 슬립에 희석 된 용액의 80 ~ 100 μl를 놓고 코트에 60 분의 coverslip의 상단 동안 품어. 전체 매체를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 삼배 된 커버를 세척 할 것. </li></ol></li></ol> 2. 성장 세포와 프로 테아 좀 억제제 치료 세포 <ol><li> 항로 2 × 10 5 비동기 적으로 성장각 35mm 접시 ING RPE1 세포는 커버 슬립을 함유하는 2 ml의 완전 배지에서 세포를 성장한다. 배양액에게 신선한 미리 예열 완료 매체와 매 24 시간을 교체합니다. <ol><li> 시험 단백질의 수준에 centrosomal 테아 좀 억제의 효과를 분석하는 (여기 VDAC3 또는 튜 불린-γ)은 44 시간 동안 두 35mm 접시에서 세포를 성장한다. 완전 배지로 배지를 교체하고, 각각 5 μM 또는 0.05 %의 최종 농도 제어 MG115 또는 용매로서 DMSO를 추가한다. 동시에, 4 시간 동안 세포를 40 μM의 최종 농도로 세포를 BrdU의 추가 배양한다. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송합니다. 각 웰에 500 ㎕의 냉각 메탄올을 추가하고 10 분이 된 커버에 세포를 해결하기 위해 -20 ° C에서 접시를 품어. 즉시 된 커버 500 μL 세척 버퍼로 3 회 세척 (0.5 mM의의 MgCl 2와 0.05 %를 포함하는 1X PBS를 트리톤-X 100). </li></ol></li><li> 잔류를 수확35mm 접시 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에서 세포. 웨스턴 블롯 (단계 6)에 의해 전체 단백질을 분석하기 위해 세포 펠렛을 사용한다. </li></ol> 3. BrdU의 펄스 체이스 분석은 다른 세포주기 단계에서 단백질 수준을 분석하기 위해 <ol><li> 44 시간 동안 커버 슬립을 함유하는 두 개의 35mm 접시에서 세포 성장, 세포주기의 다른 단계에서의 중심체에서 단백질 (VDAC3 여기서, Sas6 또는 Cep135)의 레벨의 변화를 분석한다. 40 μm의 BrdU의를 포함하는 완전한 매체와 문화 매체를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 한 접시에서, 단계 2.1.2에서 설명 된 바와 같이 냉각 된 메탄올을 사용하여 세포를 고정하는 24- 웰 플레이트로 커버 슬립을 전송. </li><li> 4 시간의 BrdU의 펄스 후, BrdU를 함유 배지를 제거 PBS로 한번 세포를 세척하고 완전 배지로 한번, 다양한 시간 (전형적으로 추가의 4 시간 동안의 BrdU의 부재 하에서 세포를 새로운 배지를 추가하고 성장할단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 고정하기 전에 RPE1 세포)에 대한. 주 : RPE1 전지, BrdU의 양성 세포의 대부분은 4 시간 후 체이스 늦은 S 또는 G2 상에있다. 이는 각각의 세포 유형에 대해 독립적으로 결정되어야한다. </li></ol> 4. 면역 염색 <ol><li> 30 분 동안 (1X PBS로 2 % BSA 및 0.1 % 트리톤-100)을 블로킹 완충액 200 μL의 고정 된 커버에 세포를 배양한다. <ol><li> 차 항체가 혼합 된 세포를 품어 가습 실에서 4 ° C에서 버퍼 O / N 차단에 희석 (일반적으로 한 토끼에서 제기하고 다른 마우스에서 제기). </li><li> 가습 실을하려면 빈 1,000 μL 피펫 팁 상자의 아래쪽에 젖은 종이 타월을 넣어. 랙 파라 필름의 표면 상에 스트립을 마련하고, 배양 될 각 커버 슬립에 대해 파라 필름 상에 항체 용액의 액적 (15 ~ 20 μL)을 더럽힐. 항체 용액의 방울에 커버 슬립을 반전 (세포 몰입되도록) 및 close팁 상자의 뚜껑. </li><li> 다시 된 커버 전환하고, 24 웰 접시에 그들을 다시 돌아갑니다. 된 커버를 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 (녹색 형광 염료 복합 항 - 토끼와 붉은 형광 염료 복합 항 - 마우스가 버퍼를 차단에 희석 여기) 150 μL 차 항체 혼합물에서 그들을 품어. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 참고 : 형광 접합 차 항체 광 감응성. 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이, 10 분 동안 -20 ℃에서 500 ㎕의 냉각 된 메탄올로 다시 염색 RPE1 세포를 고정함으로써 방지 BrdU의 염색을 위해 준비한다. 세 번 된 커버를 세척 할 것. 주 :이 고정은 다음의 단계에서 산 가수 분해 과정에서 관심 단백질 (들)의 일차 및 이차 항체 표지를 고정. <ol><li> RT에서 30 분 동안 2 N 염산 200 μL에서 세포를 배양한다. 1 M 트리스 (CL)의 300 μL, pH를 8로 중화세포를 세척 완충제로 3 회 세척 좋아. </li><li> 다시 RT에서 30 분 동안 블로킹 완충액 200 μL를 사용하여 세포를 차단. </li><li> 가습 챔버 내에서 37 ° C에서 45 분 동안 (블로킹 완충액에 희석) 래트 항 BrdU의 항체로 세포를 배양한다. , 24 웰 접시에 다시 된 커버를 돌려 그들을 씻어 준 후 실온에서 1 시간 동안 24 잘 접시에 버퍼를 차단 150 μL에 희석 블루 형광 염료 복합 항 쥐 이차 항체 (에 품어. </li></ol></li><li> 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 유리 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 함유하는 용액의 장착 방울 (약 3-6 μL)를 스팟. 셀 측이 장착 솔루션에, 아래로 향하게하여, 커버 슬립을 반전. 부드럽게 부드러운 세정 티슈를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 눌러 물기를 닦아주십시오. 현미경 슬라이드에 그것을 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 투명 매니큐어를 적용합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 이미지 Acquisition 및 분석 <ol><li> 상온에서의 BrdU 양성 RPE1 세포의 이미지를 획득 (1.4 개구 수) 100X 계획 아포 오일 침지 목표를 사용합니다. <ol><li> 디지털 이미징 할 수있는 카메라에 부착 된 현미경 (장비 참조)에 슬라이드를 넣습니다. 각각의 형광의 경우, 수동으로 실험의 모든 샘플을 검사하여 (일반적으로 300 - 1,000 밀리 초 사이) 적절한 노출 시간을 결정합니다. 셀의 이미지를 획득하기 전에 수동으로 Z 축 (일반적으로 0.2 μm의 스텝 크기)에 따라 적절한 상단과 하단에 초점면을 결정합니다. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 이용하여 Z 축을 따라 서로 다른 형광 물질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 분리 된 커버에 서로 다른 샘플의 이미지를 수집. </li></ol></li><li> Z 축을 따라 취득한 모든 화상 스택 (아니오 이웃 알고리즘을 사용하지 않고 이러한 경우) 디콘 볼 루션을 수행한다. <ol><li> 따라서 각 이미지 스택의 총 강도 투영을 구하는Z 축. </li></ol></li><li> 중심체가 (두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다) 가까이있는 세포에서 두 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 20 ~ 30 픽셀)를 그리는 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 일반적으로 24 ~ 35 픽셀)를 그려 큰 사각형의 선택 영역을 표시합니다. </li><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)을 얻었다 (S 작은 박스를 나타내고, L은 큰 상자를 나타낸다). </li><li> . 하웰 등 (29)에 의해 설명 된 공식을 사용하여 각 형광의 배경 보정 형광 강도를 분석 : F = F S - [(F의 L - F S)는 S / (A L를 - S) ×]. </li><li> 그 FL의 배경 보정 형광 강도의 비를 계산함으로써 관심 (여기 VDAC3 또는 Sas6)의 단백질의 정규화 형광 강도를 구하는(여기에 γ-tubulin에, Sas6 또는 Cep135) 선택 내부 표준에 사용되는 형광의 그것과 uorophore. </li></ol></li><li> 중심체가 잘 분리되는 경우 세포 분석의 경우, 두 개의 분리 된 박스의 도면 세트를 각각 별도로 분석 중심체 (두 중심체 사이의 거리가 큰, 2㎛ 이상이다). 각 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 15 ~ 25 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 20 ~ 30 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)를 얻어, 단계 5.3.3에서 설명 된 바와 같이, 각각의 중심체 별도로, 각 형광 물질의 배경 형광 농도 보정을 계산한다. </li><li> 그 셀에서 해당 단백질의 총 centrosomal 레벨을 얻기 위해 두 중심체에서 각 단백질의 배경 형광 농도 보정 수확기. </li><li> 취득내부 표준 물질의 총 centrosomal 강도 총 centrosomal 강도의 비율을 계산하여 관심 단백질 정규화 강도. </li></ol></li><li> 각 실험 조건에 대해 적어도 15-25 세포를 분석하여 스프레드 시트의 그래프를 플롯. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅을 사용하여 총 단백질 분석 <ol><li> 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 % Nonidet P-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 (RIPA) 버퍼 radioimmunoprecipitation 분석에서 세포를 재현 탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션 용균. <ol><li> 10 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하여 펠릿 분획으로부터 해물을 분리 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 키트를 사용하여 각 분해물의 총 단백질 농도를 측정한다. </li></ol></li><li> 4X SDS-PAGE 로딩 완충액 (50 mM Tris-CL, pH가 6.8, 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.1 % 브롬으로 40 μg의 해물 믹스) 블루 ophenol. <ol><li> 10 분 동안 샘플을 비등 200 V.의 정전압으로 SDS-PAGE 변성 12.5 %의 샘플을 실행할 </li></ol></li><li> (냉간에서 1 시간 90 V의 정전압) 웨스턴 블로 팅 기법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상으로 SDS-PAGE상에서 분리 된 단백질을 전송. <ol><li> 1X PBS에서 3 % 무 지방 우유 멤브레인을 차단 한 다음 1 (이 경우 토끼 방지 VDAC3, 토끼 반 γ-tubulin에와 마우스 항-α-tubulin의)에 희석 차 항체의 솔루션을 막을 배양 실온에서 시간. </li><li> 멤브레인을 PBS-T 완충액 3 회 (진탕 각 5 분 인큐베이션) 세척 한 후 (1X PBS 및 0.2 %의 트윈 -20), 근적외선 (IR​​) 형광 염료 공액 항 - 토끼의 혼합물에 막을 부화 1 시간 동안 (PBS-T에 희석) IR 형광 염료 공액 항 - 마우스 이차 항체. </li><li> 막 세 번 세척 한 후 적외선 F를 사용하여 대역을 분석 막을 검색면역 검출에 적합한 luorescence 촬상 시스템. </li></ol></li></ol>

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Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li><li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels.">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li><li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened:+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process.">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li><li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특?...

중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 (19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 (23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다. 본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 24 ~ 27의 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다. 여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다. 따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 - 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 16, 28을 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 (16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock of 1 mg/ml in water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF blocking buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&amp;nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rat monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H&amp;amp;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland antibodies</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Round coverslips 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 numerical aperture</td></tr><tr><td>Slidebook software package</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요​​한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.

우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins 16, 28 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 (16)에</sup...

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K 조회수.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

연구

생화학

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

생물학

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

신경과학

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

요약

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정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

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높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한 워크 플로우

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

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