CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1. Electroporate HH12-13 닭 배아의 신경 튜브 OVO의 관심의 구조물 형질 전환의 만족 수준이 개인의 빠른 식별을 가능하게하기 위해, 바람직하게는 시스 트론 성적 증명서, 형광 기자를 사용하거나 인터 바이러스 2A 펩타이드 (11)와 함께 관심의 단백질에 융합. 참고 :이 단계에 대한 일반적인 배양 시간은 37.8 ° C에서 약 48 시간이다. <ol><li> 18 G X 1 1/2 바늘에 연결된 주사기와 알부민의 3 ㎖를 제거한 후 계란에있는 작은 창을 엽니 다. 배아 시각화를 향상시키기 위해, 배아 1-4 아래 멸균 링거액에서 1:50 희석 인도 소량의 잉크를 분사. </li><li> 멸균 링거액과 배아를 커버 한 후, 2.5 μg의이 신경관의 후방 말까지 DNA가 채우기 / 때까지 μL를 포함하는 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.2 및 0.1 % 식품 염료 (F, D &amp; C) 솔루션을 주입후뇌 지역까지. 상기 측면 영역을 따라 4mm (1)에 의해 분리 된 위치 백금 전극 (직경 0.5 mm)를 electroporate하고 (4) 사이의 100 밀리 초 간격으로 5 내지 50 밀리 초 펄스 및 20 V를 제공한다. </li><li> 전기 후, 그들은 무대 HH23에 도달 할 때까지 더 48 시간 동안 조작 배아를 배양시키고, 형광 실체 현미경을 이용하여 측면 지역에서 형질의 높은 수준을 제시 개인을 식별 할 수 있습니다. NOTE : 일렉트로 후 배양 기간은 실험의 목적에 의존한다. 일렉트로 플라스미드는 2 시간이 후에 상당한 발현 수준을 생성 할 수있다. 관심 조발성 유전자에 놓여 있다면 따라서, 이후 일렉트로 잠복기가 감소 될 수있다. </li></ol> 2. 수확 성공적으로 배아 형질과 일렉트릭 척수 반쪽을 해부하다 참고 :이 절차는 각 10 배아 및 수익률 1 ~ 3 시간까지 지속-2 배아 당 μg의 총 RNA. 신경 튜브의 해부는 좋은 움직임을 필요로하고 연습 세션은 실험 시료에 적용하기 전에해야 할 수 있습니다. <ol><li> 의 RNase의 오염 제거 용액 또는 4 시간 12 150 ℃에서 소성하여 금속 해부 도구의 오염을 제거하고 DEPC 처리 된 PBS를 준비합니다. 만 새로운 인증의 RNase없는 plasticware에 사용합니다. NOTE : 수확 후에는 박리시의 RNase 오염을 방지하기 위해 표준 치료를 수행하는 것이 중요하다. </li><li> 미세 해부 가위와 정립 수집 숟가락을 사용하여 배아를 수확. 100mm 페트리 접시에 차가운 DEPC 처리 된 PBS에서 배아를 보관하십시오. </li><li> 미세 핀셋으로 (전방 사지 꽃 봉 오리와 후방 사지 새싹의 전방 한계의 후방 한계 사이의) 전체 측면 영역을 잘라 차가운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 새로운 요리에이 부분을 전송할 수 있습니다. </li><li> 세 가지를 관통하는 두 개의 미세 유리 바늘을 사용하여신경 튜브와 근축 중배엽 사이의 배아 각각의 배 외측면에 가리 킵니다. </li><li> 중앙 구멍에 두 개의 유리 바늘을 소개하고 천천히 신경관 전후방 축을 따라 그 중 하나를 멀리 이동합니다. 첫 번째 움직임에 의해 도달되지 않은 구멍에 대해이 단계를 반복합니다. 미세 핀셋으로 분리 된 근축 중배엽를 제거합니다. </li><li> 옆으로 배아를 돌려 신경관과 척색 사이의 핀셋의 끝을 삽입하고 두 개의 구조를 분리하는 전후방 축 방향의 반대 방향으로 그들을 밀어 넣습니다. 참고 :이 또한 중배엽의 대부분은 여전히​​ 신경 튜브에 부착 제거해야합니다. </li><li> 필요한 경우 가볍게 핀셋의 또 다른 쌍의 신경 튜브를 잡고 핀셋으로 잡아 당겨 부착 된 상태로 유지 mesodermic 조직의 더 큰 조각을 제거합니다. 완료되면, 부드럽게를 사용하여 추운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 다른 요리에 신경 튜브를 전송의 RNase없는 유리 파스퇴르 피펫은 수동 피펫 펌프에 연결된 모든 튜브 해부 될 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 두 부분으로 신경 튜브를 나눈다. 이를 위해, 루멘에 핀셋의 폐쇄 된 한 쌍의 날카로운 끝을 삽입하고 그것을 통해 핀셋을 이동하여 지붕 판을 엽니 다. 그 후, 핀셋 팁 바닥 판을 절단하여 절반을 분리. </li><li> 정렬 얼음처럼 차가운 DEPC 처리 된 PBS로 가득 1.5 ML 튜브에 형광 해부 범위 및 전송에서 비 일렉트로 반쪽에서 일렉트로. 필요한 경우, 플라스틱 벽에 부착 된 조직을 분리하고 튜브의 침전을 촉진하기 위해 부드럽게 마이크로 튜브를 가볍게. </li><li> 3 초 동안 100 XG에 스핀과 1 ml의 마이크로 피펫으로 가능한 한 PBS로 매우 천천히 제거합니다. 어떤 배아 물질이 피펫 팁에 흡입되어있는 경우 모니터하기 위해 마이크로 튜브를 통해 빛난다 광원을보고하는 동안이 작업을 수행; 이 경우, 천천히 방전 centrifuga를 반복기. </li><li> 신경관 절반 당 RNA 추출을위한 분해 용액 70 μl를 추가하고 내용을 혼합 튜브를 가볍게. 격렬하게 5 분와 소용돌이 실온에서 인큐베이션. 5 분 배양과 와동 두 번 더 반복합니다. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 다음 단계에 대한 충분한 수율을 보장하기 위해 샘플 당 최소 8 신경관 반쪽를 수집합니다. 여러 전기 / 해부 세션이 신경 튜브의 충분한 수를 축적해야하는 경우 작은 샘플을 풀. 각 조건에 대한 중복 또는 삼중 충분한 샘플을 보관합니다. </li></ol> 3. Purify는 RNA와 Illumina의 시퀀싱 라이브러리를 준비 <ol><li> -80 ° C 저장에서 샘플을 제거하고 15 ~ 30 분 동안 얼음에 배치합니다. 완료 될 때까지 실온에서 해동을 다시 시작합니다. </li><li> 와동 잘 5 분 동안 실온에서 떠난다. 1 분 15,000 XG에 다시 소용돌이 원심 분리기는 불용성 물질을 펠렛. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는을 전송및 총 RNA 분리 키트 설명서 지침에 따라 RNA 추출을 진행합니다. 농도를 증가시키기 위해 최소의 부피로 용출시켰다. NOTE : 청소 후 DNase를 처리 RNA-SEQ 셋 게놈 DNA 서열의 오염 가능성을 피하기 위해 권장된다. </li><li> 내용물을 혼합하고 품질 관리 분석을위한 5 μl를 제거하는 튜브 톡. 라이브러리 준비까지 C ° -80에서 나머지 샘플을 보관; 이들 샘플은 RNA의 분해를 방지하기 위해 단 한번만 해동되어야한다. </li><li> RNA 6000 나노 키트를 사용하여 Bioanalyzer 상품에 정제 된 RNA를 실행; RIN 값은 최소 7 위의 진행을해야합니다. </li><li> 일루미나 호환 RNA-SEQ 라이브러리 준비 키트를 사용하여 라이브러리를 생성하고 하나의 읽기 (100) BP를 생성하기 위해 설정 HiSeq 악기의 한 차선에서 4 라이브러리에 멀티 플렉스. 가능하면, 잠재적 인 기술 유물을 최소화하기 위해 같은 실행의 모든​​ 샘플을 포함한다. 참고 :이 5000 만 R까지 양보해야대부분의 유전자 (13)에 대한 커버리지를 얻을 수있을만큼보다 더 샘플, 당 EADS. </li></ol> 4. 갤럭시 공용 서버 (10)에 RNA-SEQ 데이터 집합을 비교. 참고 : 서버 저장 공간이 제한되며 많은 샘플을 비교 실험 필터링 단계에서 생성 된 중간 파일의 삭제를 요구할 수있다. <ol><li> (갤럭시 공개 서버에 사용자 계정을 만듭니다 <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) 및 FTP는 fastq 형식으로 Illumina의 데이터 세트를 업로드 할 수 있습니다. </li><li> NGS에서 FastqGroomer (14) 도구를 사용하여 업로드 된 파일 준비 : 품질 관리 및 조작 메뉴를; 품질 평가 점수가 이미 Phred + 33 (생거)으로 인코딩 된 경우, 단순히 각각의 데이터 세트에 대한 속성에서 fastqsanger하는 파일 형식을 변경하여이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> QC 및 조작 나를 : 일반 NGS에서 FastQC 도구를 사용하여 각 데이터 세트의 품질 분석뉴. 참고 :이 읽기의 끝을 트리밍에 사용되는 매개 변수에 대한 추정치를 제공하므로 특별한주의가 염기 서열의 품질 별, 염기 서열의 콘텐츠에 대한 결과 그래픽 고려되어야한다. </li><li> 트림 3 &#39;폐기 읽는 도구 NGS에서 FASTQ 품질 트리머 (14) 사용하여 낮은 품질의 데이터로 끝나는 : 품질 관리 및 조작 메뉴를 표시합니다. 만 3 &#39;가 20 아래 품질 평가 점수에 대한 종료 처리하기 위해 도구를 설정합니다. </li><li> 클립 도구 (사용하여 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> QC 및 조작 메뉴 : NGS 아래 참조). 왼쪽보다 45 bp의 입력에 사용되는 어댑터의 순서로 읽어 버리고 모두 클리핑 및 비 클리핑 된 시퀀스를 포함하는 출력을 선택할 수있는 도구를 설정합니다. 또한, 가장 낮은 품질의 기지가 이미 마지막 단계에서 제거 된 이후 알 수없는 기지와 시퀀스를 폐기하지 않는 선택. </lI&gt; <li> 도구 트림 시퀀스 (사용 <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> NGS 아래)가 FastQC에 의해 검출 된 5 &#39;시퀀스 바이어스 (일반적으로 10)를 제거하기 위해 읽기의 ​​품질 관리 및 조작 메뉴를 첫 번째 기지 트림. 참고 :이 시점에서, 다시 FastQC을 실행하고 데이터 세트의 품질이 향상되었는지 확인하기 위해 이전의 분석과 비교하는 것이 좋습니다. </li><li> 다운로드 일루미나 iGenomes에서 UCSC 게놈 브라우저의 최신 닭 게놈 어셈블리를 풀고 ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) 전체 게놈 FASTA 형식 파일 및 유전자 주석 GTF 형식의 파일을 업로드 데이터 가져 오기 메뉴에서 도구 파일 업로드를 사용하여 갤럭시 역사. </li><li> 지도하에 얼 라이너 (15)를 사용 TopHat2 닭 게놈에 각 샘플에 대해 읽NGS : RNA 분석 메뉴. 역사에서 게놈을 사용하기로 선택한다 (단계 4.7에서 업로드 FASTA 파일을 선택합니다). </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 커프스 16 사용하여 각 샘플에 대한 예측 사체를 구축 할 수 있습니다. 가이드로 참조 주석을 사용한다 (단계 4.7에서 업로드 GTF 파일을 선택)하고 옵션을 켭니다 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행하고 다 읽어 올바른 사용하도록 선택합니다. </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffmerge (16)를 사용하여 모든 샘플에 대한 예측 transcriptomes를 병합합니다. (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일) 및 시퀀스 데이터 (단계 4.7에서 GTF 파일) 참조 주석을 사용하여 선택합니다. </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffdiff 16 사용하여 각 샘플에 대한 TopHat2에 의해 생성 된 BAM 파일을 비교. 필드 성적 증명서에서 나를 선택rged 사체는 Cuffmerge에 의해 생성 옵션 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행 켜고 다 읽어 올바른 사용합니다. </li><li> 정렬 차동 표현은 필터에서 도구 정렬을 사용하여 숫자 열 (13) (Q 값)의 상승 테이블을 테스트하고 메뉴를 정렬합니다. 참고 : 유전자 / 가장 낮은 Q 값을 제시한다 실험 조건 사이에 상당한 차이 식을 보여주는 성적 증명서. </li><li> 범위 그래프를 시각적으로 결과를 확인하려면 먼저 도구가 BEDTools 메뉴에서 게놈 범위 (17)의 BedGraph를 작성하여 bedGraph 형식으로 BAM 파일을 변환합니다. 보험이없는 지역의보고를 사용하지 않도록 설정, 별개의 간격으로 접합 항목을 처리하고 모든 데이터 세트가 비교되는 염기 서열 깊이를 정규화 계수로 적용 범위를 확장하기 위해 선택합니다. </li><li> 을 사용하여 중요 인물 형식 얻어진 bedGraph 파일 변환도구 가발 / BedGraph - 투 - 중요 인물 ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) 변환 형식 메뉴에서. UCSC 게놈 브라우저 (사용자 지정 트랙으로 중요 인물 파일을 업로드 <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> galGal4 어셈블리)와 데이터 세트의 범위를 시각적으로 관심의 유전자를 검색 할 수 있습니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에서 우리는 닭 척수의 전기 후 효과 분석을위한 지침을 제공합니다. DNA 벡터의 전기가 더 자주 관심의 유전자를 과발현하는 데 사용되지만, 하나는 또한 유전자 기능 녹다운 조건 19-21를 생성하는 siRNA를 위해 우성 네거티브 quimeric 또는 전구체 단백질을 코딩하는 구조를 이용할 수있다. 실제로, 이득 - 및 기능 상실 분석 모두에 기인 사체 프로파일의 비교는 차별적 따라서 전위가 더 ...

OVO 전기에 DNA 1-5을 구성하여 부분적으로 생체 내에서 배아 구조에 감염 될 수있는 빠르고 저렴한 방법을 나타 내기 때문에 살아있는 유기체에 유전 연구는 자주 모델로 닭 배아를 사용합니다. 이러한 pCIG 6 pMES 7과 같은 목적 유전자와 함께 형광 리포터를 함유 한 증명서를 인코딩 시스 트론 발현 벡터, 하류 분석 배아를 처리하기 전에 실체 현미경을 이용하여 원하는 영역에 형질 전환 품질의 빠른 확인을 허용한다. DNA 시퀀싱 최근 발전으로, 그것은 RNA-SEQ 8,9을 사용하여 RNA 샘플들로부터 디지털 전 사체 발현 프로파일을 획득하는 것이 가능하다. 따라서, 대신 그러한 계내 혼성화, 면역 조직 화학 및 qPCR에,의 cDNA 라이브러리의 제조에서와 같이 병렬로 몇 유전자 산물의 분석을 가능하게 시간이 걸리는 방법높은 처리량 시퀀싱 전 사체의 정보를 제공 할 수있다. 모든 단일 유전자의 발현 수준에 대한 효과 실험 관찰 차례로 사용 구조체에 의해 변경 경로에 강력한 통찰력을 제공 할 수있다. 이 사용 유기체의 게놈 어셈블리를 사용할 수있는 경우 특히 쉽고, 따라서 병아리 배아는 다시 적당한 모델이다. 사용자가 신뢰할 수있는 게놈 시퀀싱 센터에 액세스하는 경우, 주요 문제는 고품질의 RNA 샘플을 획득한다. 본 연구는 생성 된 데이터 세트의 실리코 분석을 위해 RNA-SEQ 적합한 형질 신경 튜브뿐만 아니라 하류 단계로부터 RNA 샘플을 얻는 방법을 설명한다. 48 시간 배양 한 다음 HH12-13에 전기 한 후, 형질 전환 된 트렁크 척수 절반은, 리보 뉴 클레아가없는 상태에서 해부 즉시 용해 및 추가 RNA 정화 및 라이브러리는 준비 될 때까지 매우 낮은 동결에 의해 분해로부터 보호했다이온. 갤럭시 공공 서버 (10)는 높은 처리량 시퀀싱 데이터 분석을위한 무료 자원에 대한 액세스를 제공합니다. 등록 된 사용자를 위해 제공되는 공간의 크기는 국부적 계산 된 기반 구조에 대한 필요성을 제거, 소형 실험에 충분하다. RNA-SEQ 데이터 분석 필터링, 정렬 및 유전자 발현의 정량 / 비교를 포함한다. RNA-SEQ 데이터 분석에 대한 일반적인 가이드 라인이 있지만, 필터링 파라미터 시퀀싱의 품질에 크게 의존 할 것으로 예상되며, 원 데이터의 품질 관리 분석을 통해 결정되어야한다. 이 프로토콜은 획득 및 생체 내에서 형질 전환 닭의 배아 척수에서 RNA-SEQ 프로파일을 비교하는 단계에 대해 설명합니다. 대표적인 결과, 빈 벡터로 형질 개의 독립 제어 샘플들로부터 얻어진 데이터 세트의 비교 방법은 재현성 및 차등 EXPRES의 식별을 허용한다는 것을 보여 주었다실험 샘플에 나오지도 성적 증명서. 따라서, 이러한 방법의 응용이 크게 하나의 실험 후에 발견의 수를 증가하고, 따라서 후속 조사를 위해 큰 데이터 세트를 제공하는 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>Indian ink</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D &amp;amp; C Blue 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Food Dye used to visualize DNA injection</td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 7.2 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.225 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.217 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.02 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Filter and autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 8 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1.15 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L and filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieved spoon</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase decontamination solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Fine point surgical scissors</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight fine point tweezers</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9&#039;&#039; glass Pasteur pipette</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manual pipette pump</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAlater solution for RNA stabilization</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous total RNA isolation kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

설명 된 방법을 검증하기 위해, 두 개의 제어 샘플은 빈 벡터 pMES 7 삽입 닭 SCRT2 (18)의 아연 손가락 도메인을 인코딩 SCRT2-ZNF를, 구성이 포함 된 동일한 벡터로 형질 전환 된 배아에서 하나의 샘플에 electroporation하여 배아에서 발생했다. 각 11-22 μg의 총 RNA를 산출 샘플은 8 ~ 12 배아의 풀에서 얻었다. 모든 3 개의 시료 고품질 RNA이 프로토콜로 얻을 수있는 것을 보여주는 Bioanalyzer 기기 ...

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RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K 조회수.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

비디오: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

연구

유전학

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

발생학

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

신경과학

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

생물학

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

화학

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...