Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
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이 프로젝트는 바덴 - 뷔 르템 베르크, 독일에 유럽 사회 기금에 의해 투자되었다.

필수 DNA 시퀀스를 코딩 포함하는 플라스미드 1. 확대 술 (CDS) <ol><li> 사전 따뜻한 실온으로 변환 키트에 포함되어 SOC 배지, 37 ° C, 100 ㎍ / ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트. 42 ° C의 물을 욕조를 평형. </li><li> 화학적 구성 요소 E. 중 하나 유리 병을 해동 얼음에 대장균. </li><li> 화학적 성분의 E. 바이알 내로 CDS 함유 플라스미드 1-5 μL (100 ng의 10 페이지)를 첨가 대장균과 부드럽게 섞는다. 피펫 팅하여 세포를 혼합하지 마십시오. 플라스미드를 추가 한 후, 부드럽게 튜브를 눌러 섞는다. </li><li> 30 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열 충격 E. 흔들림없이 물을 욕조에 42 ° C에서 30 초 동안 대장균. </li><li> 2 분 동안 얼음에 병을 놓습니다. </li><li> E.에 예열 SOC 매체의 250 μl를 추가 대장균은 세균 배양기에서 37 ° C에서 1 시간 동안 300 rpm에서 수평으로 박테리아를 흔들어. </li><li><html> 100 μL와 미리 예열하는 LB 아가 플레이트에 변환 믹스 150 μl를 확산 판을 반전 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 콜로니가 표시되고 나면, 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린 5 ㎖의 LB 배지를 함유하는 15 ㎖의 배양 관에 각각 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종. 문화가 늦게 로그 또는 고정 단계가 될 때까지 300 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤을 품어. </li><li> 형질 전환 된 E.의 장기 저장 용 콜라이, 피펫 cryovial으로 100 % 글리세롤 75 μl를. 세균 배양 (냉동 주식이 25 % 글리세롤을 포함한다)의 225 μl를 추가, 잘 섞는다 및 -80 ° C에서 cryovial를 저장합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 필요한 CDS를 함유하는 플라스미드를 분리. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 결정한다. </li><li> 20 μL의 분량을 준비하고 오랜 시간 동안 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol>플라스미드 삽입물 _title &quot;&gt; 2. 증폭 및 중합 효소 연쇄 반응에 의해 폴리 T 꼬리의 추가 (PCR) <ol><li> 참고 : PCR을 이용하여 증폭 시험 관내 전사 (IVT), 여기에 관심있는 CDS, eGFP는 대한 DNA 템플릿을 구하십시오. 동시에, 120 티미 딘 (T)의 폴리 T-꼬리는 T (120) 확장자 역 프라이머를 사용하여 삽입에 추가됩니다. 이에 의해, 생성되는 mRNA IVT 후 정의 된 길이의 폴리 A-꼬리를 얻었다. </li><li> 표 1에서 설명하는대로 PCR 혼합물을 준비합니다. </li><li> 완전히 반응 혼합물을 섞는다. NOTE : PCR 생성물은 4-5 IVT 반응에 사용될 수있다. IVT 용 DNA 템플릿 량을 증가시키기 위해, PCR 혼합물의 총 체적이 증가 될 수있다. 몇몇 PCR 튜브 각각 함유하는 100 ㎕의 PCR 혼합물을 PCR 생성물의 충분한 수율을 확보 할 수있다. </li><li> PCR 열 순환기에 튜브를 놓고 PCR 사이클링 프로토콜 (표 2)를 사용하여 PCR을 실행. </li><li> P는 정리20 ㎕의 뉴 클레아 제 -없는 물을 사용하는 DNA는 제조업체의 지침에 따른 용출 및 PCR 정제 키트를 이용하여 CR 반응. </li><li> 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 참고 : 감지 DNA 농도가 약 300 ㎍ / ㎖의입니다. 따라서, 예상 총량은 ~ 6 μg의이어야한다. 다른 단백질에 대한 DNA의 양은 CDS의 길이에 따라 달라질 수 있으며, 플라스미드의 양은 PCR, 프라이머 어닐링 온도 및 싸이클 횟수에 사용. </li><li> 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 DNA 동결 또는 IVT 직접 사용. </li></ol> 3. 조정 단계 : PCR 제품의 품질 <ol><li> DNA 겔 전기 영동에 의해 PCR 산물의 품질을 확인. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 젤 상자에 젤을 부어 콤을 설정하고 젤 응고 될 때까지 약 1 시간을 기다립니다. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 12 μL의 총 부피의 2 μL 6 배 로딩 버퍼 80-10,000 염기쌍의 DNA 사다리의 2 μL (200 NG) 및 PCR 제품의 200 NG를 각각 섞는다. </li><li> 조심스럽게 아가로 오스 겔의 우물에 DNA 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여, 1 시간 동안 100 V에서 아가 로스 젤을 실행합니다. </li><li> 이미징 시스템 (도 2)의 DNA 밴드를 시각화. </li></ol> 4. 시험 관내 전사 (IVT) <ol><li> NOTE는 : PCR 후, 플라스미드 인서트 증폭 및 폴리 T 꼬리 첨가된다. IVT 동안, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 전사된다. 생성 된 mRNA의 성적 증명서는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. </li><li> 의 RNase D와 작업 영역과 피펫을 청소오염 제거 솔루션입니다. 반응이 RNases와 혼합의 자주 사용하는 PCR 깨끗하고 무균 이중 필터 피펫 팁과 오염을 최소화하기 위해 장갑을 변경합니다. </li><li> 표 3에 기재된 바와 같이 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 준비한다. </li><li> 와동에 의해 철저하게 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 혼합하고 짧게 스핀 다운. </li><li> 표 4에 기재된 바와 같이 IVT 반응 혼합물을 조립한다. </li><li> 부드럽게 피펫 팅 아래에 의해 철저하게 IVT 반응 혼합물을 섞는다. 이어서 튜브의 하단에 혼합물을 수집 짧게 PCR 튜브를 원심 분리기. </li><li> 써모에서 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 최적의 배양 시간이 삽입 주어진 템플릿의 전사 효율의 길이에 따라 달라집니다. 짧은 삽입 (NT &lt;500)의 경우, 더 긴 배양 시간이 유리할 수있다. 경시 실험을 최대 수율을위한 최적의 배양 시간을 결정하기 위해 행해질 수있다. 따라서, exampl를 들어, IVT 반응을 설정즉, 1, 2, 3, 4, 6 시간, 밤새 인큐베이션하고 mRNA의 양을 결정한다. eGFP는 mRNA의 생성에 대한 시험 관내 전사의 동력학은도 3에 도시된다. </li><li> , 주형 DNA를 제거 IVT 반응 혼합물에 DNase의 1 μL (2 U / μL)를 추가하려면, 잘 혼합하고 37 ℃에서 15 분을 품어. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 40 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. NOTE : 검출 된 RNA의 농도는 약 1500 ㎍ / ml 일. 따라서, 예상 총량은 ~ 120 μg의이어야한다. 다른 단백질 합성의 mRNA 양 CDS의 길이와 IVT 사용되는 PCR 산물의 양에 따라 다를 수있다. </li></ol> 남극 인산 가수 분해 효소 정제 된 mRNA를 5. 치료 <ol><li> 참고 : 생성 된 mRNA의 5를 제거하기 위해 포스 파타 아제로 처리 &#39;트라이면역 활성화에 RIG-I에 의해 인식 이어질 수 있습니다 인산염. 또한, 인산 처리는자가 결찰 반응에 다시 회람을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정제 된 mRNA의 솔루션의 79 μL에 10 배 남극 포스 파타 아제 반응 버퍼 9 μl를 추가합니다. 그 후, 남극 포스 파타 아제 (5 U / μL)의 2 μL를 추가하고 부드럽게 샘플을 섞는다. 30 분 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 50 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 변형 된 mRNA의 농도를 측정한다. 260 nm의 체크인 / 280 nm에서의 흡광도의 비율 (A (260) / A (280)) ≥ 1.8 내지 260의 비율 / A (230)의 순도를 나타내는, 인을 2.0이라고. 참고 : 예상 총 생산량은이 sufficie이며, 약 90 μg의해야NT 약 36 mRNA의 형질합니다. </li><li> 클레아없는 물을 첨가하여 100 ng의 / μL로의 mRNA의 농도를 조정. </li><li> -80 ° C에서 형질 및 저장에 필요한 일회용 씩에 수정 된 mRNA의 나누어지는. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오. 제대로 준비하고 mRNA를 몇 년 동안 안정 저장됩니다. 작업하는 동안 항상 얼음에 수정 된 mRNA를 유지합니다. </li></ol> 6. 조정 단계 : 종합 된 수정 된 mRNA의 품질 <ol><li> RNA 겔 전기 영동에 의해 수정의 mRNA의 품질을 확인합니다. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 겔 상자에 겔을 붓고 빗 설정하고 겔 솔리 때까지 약 1 시간을 기다려dified. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 0.5 ~ 10 KB의 RNA 사다리의 3 μL (3 μg의)와 mRNA의 10 μL의 총 부피의 7 μL 로딩 버퍼 각각 수정하여 합성 200 NG를 섞는다. 로딩 완충액의 조성은 표 5에 기재되어있다. </li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 사다리와 mRNA의 샘플을 변성시킨다. </li><li> 조심스럽게 사다리와 1 % 아가 로스 젤에서 mRNA의 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여 1 시간 동안 100 V에서 전기 영동을 수행합니다. </li><li> 젤 문서 시스템 (그림 4)를 사용하여 자외선 transilluminator가와 사진에 사다리와 mRNA의 밴드를 시각화. </li></ol> 7. 형질에 대한 세포의 준비 <ol><li> 12 웰 플레이트 잘 당 판 (2) X10 5 세포 (HEK293 세포). </li><li> 세포 배양기에서 37 ° C에서 밤새 세포를 부화. 참고 : 형질의 날에, 세포가 REAC해야한다80-90 %를을 hed. </li></ol> 8. 세포의 mRNA 트랜 수행 <ol><li> 수정 된 mRNA를 해동. </li><li> 형질 전환에 대한 리포 플렉스를 생성합니다. </li><li> 수정 mRNA의 25 μL (2.5 μg의) 내가 12 웰 플레이트 잘 하나의 형질 전환을위한 형질 전환 혼합물을 생성하는 혈청 배지를 감소 473 μL 옵티-MEM (최소 필수 중간)에 양이온 성 지질 형질 전환 시약의 2 μL를 추가합니다. 형질 전환되는 우물의 수에 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. 음성 대조군으로, mRNA를하지 않고 형질 전환 혼합물을 제조. </li><li> 부드럽게 피펫 팅하여 컴포넌트를 섞는다. 형질 감염을위한 리포 플렉스를 생성하기 위해 20 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 인큐베이션. 참고 : 형질 전환 혼합물이 항생제가 포함되어 있지 않습니다. 따라서, 세포를 처리하는 동안 불임을 보장하기 위해주의를 기울입니다. </li><li> 500 μL의 DPBS와 세포를 씻으 / 웰. </li><li> 12도 괞 찮아 잘 하나에 형질 전환 혼합물 μL 500 추가테. </li><li> 37 ° C에서 4 시간, 5 % CO 2 세포를 부화. </li><li> 형질 전환 혼합물을 대기음 세포에 1 ml의에게 완전한 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 세포 배양기에서 24 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 형광 현미경을 수행하면 형광 현미경 (도 5)를 사용하여 분석한다. NOTE는 : eGFP는 이외의 mRNA는 mRNA의 코딩에 의해 생성되는 형질 전환 세포에서 다른 단백질의 발현을 조사하기 위해서, 세포는 커버 슬립에서 배양 될 수있다. 이어서 형질 감염이 수행 될 수 있고, 세포를 적절한 항체로 염색하고 형광 현미경으로 분석 될 수있다. </li></ol> 세포의 eGFP는 표현의 9 유세포 분석 <ol><li> 웰로부터 세포 배양 배지를 제거하고 (칼슘 및 마그네슘없이) 1 ㎖의 DPBS로 각 웰을 세척 하였다. 세포 배양 플레이트의 표면으로부터 세포를 분리하는 웰 당 500 ㎕를 트립신 / EDTA를 추가한다. 계속해서, (500)을 추가μL TNS 당 잘 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 실온에서 300 XG에서 5 분 동안 분리 된 세포를 원심 분리기. 만 펠렛을 떠나 뜨는을 제거합니다. 150 ㎕의 세포 고정액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유세포 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> eGFP는 발현 세포의 비율 및 평균 지오 (형광 강도의 기하 평균) (도 6)를 사용하여 형광 강도를 분석. </li></ol> 시간 이상 단백질 발현 10. 측정 <ol><li> 또한 단계 8에 기재된 바와 같이, 12- 웰 플레이트의 웰 (3)의 셀의 mRNA 트랜 수행 mRNA를 첨가하지 않은 형질 전환 혼합물로 HEK293 세포를 웰 3을 배양한다. </li><li> eGFP는 1, 2의 발현을 측정, 3 일 후 형질 전환 단백질 발현 (도 7)의 지속 기간을 평가. </li></ol>

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	<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+&amp;#34;gene+therapy&amp;#34;.">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &amp;#34;gene therapy&amp;#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li><li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+Optimized+Wilms&amp;#34;+Tumor+1+(WT1)+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo.">Design of an Optimized Wilms&amp;#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).</li><li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized,+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection.">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors.">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li><li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation.">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery &amp; development. 10, 523-532 (2007).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency.">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li><li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression.">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

mRNA의 치료는 재생 의학, 질병 및 예방 접종의 치료 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 이 비디오는, 세포에서 단백질 발현의 유도를위한 안정화 된 변형의 mRNA의 생성을 보여준다. 이 프로토콜을 이용하여, 다른 원하는 mRNA를 생성 할 수있다. 변형 된 mRNA를 시험 관내 합성은 표적 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직 mRNA를 함께 세포의 형질 감염을 허용한다. 외생 전달 mRNA를 완전히 ...

세포에서, 전령 RNA의 전사 (mRNA의) 원하는 단백질 내로의 mRNA의 번역은 다음 셀의 적절한 기능을 보장한다. 유전 또는 획득 한 유전 질환 단백질의 부족과 장애 합성으로 이어질 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 결함이 없거나 단백질의 생산을 유도하는 새로운 치료 방법은 세포 내로의 mRNA 합성의 개질 외인성 전달, 목적 단백질을 코딩이다. 이에 따라, 세포가 정상적으로 생성되지 않거나 자연적으로 필요하지 않을 기능 단백질을 합성하는 트리거됩니다. 이 방법을 사용하여, 유전 질환의 mRNA의 도입에 의해 보정 될 수없는 결함이 있거나 한 단백질을 코딩. mRNA의 치료는 또한 종양 세포 또는 병원체에 의해 발현 된 단백질 항원을 접종 synthetize하기 위해 사용될 수있다. 이에, 숙주 면역 시스템은 효과적으로 종양 세포를 제거하거나 infe을 방지하기 위해 활성화 될 수있다ctions 2,3. 또한, 최근에는 mRNA를 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기 위해 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 섬유 아세포 리 프로그래밍의 발현이 4-6 인자 유도 및 재생 의학에 막대한 잠재력 iPSCs으로 변환하는 mRNA를 함께 형질 감염시켰다. 이전에, 종래의 mRNA의 사용은 낮은 안정성과 강한 면역 원성 연관되었다. 따라서, 기존의 mRNA의 임상 적용은 제한되었다. 그러나 Kariko과 동료의 mRNA 분자 내에 5 메틸 시티와 pseudouridine로 시티 딘과 딘의 교체는 생물학적 유체 안정의 mRNA 분자를 렌더링 극적으로 지금 수정의 mRNA의 임상 적용을 허용 면역 활성화 7-10 감소. 합성으로 생산 된 수정의 mRNA를 사용하여, 원하는 유전자 성적표는 일시적으로 생체 (11)에 전달 될 ​​수또는 시험관 내에서 단백질 발현을 유도한다. 도입의 mRNA는 세포 번역 기계에 의해 생리 학적 조건에서 변환됩니다. 인해 바이러스 유전자 치료 벡터에 비해 숙주 세포 게놈 내로 통합의 부족으로, 종양의 위험도 12,13 방지된다. 따라서, 수정 합성의 mRNA를 사용하여 치료 이후에보다 좋은 임상 승인을 얻을 것이다. 여기에, 우리는 수정 된 mRNA를 생산 (그림 1)의 mRNA와 세포와 형질 전환 된 세포에서 단백질 발현의 평가, 형질 전환에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&amp;nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml conical tubes&amp;nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &amp;micro;l: 022491202; 100 &amp;micro;l: 022491237; 1,000 &amp;micro;l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plasmid amplification and purification&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Dissolve 25 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Dissolve 40 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;mRNA production&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&amp;acute;-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;)G RNA cap structure analog&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&amp;micro;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&amp;micro;l (from MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Cationic lipid transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Gel electrophoresis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flow cytometry analyses&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;-TTGGACCCTCGTAC&lt;br /&gt;AGAAGCTAATACG-3&amp;acute;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;- T&lt;sub&gt;120&lt;/sub&gt;-CTTCCTACT&lt;br /&gt;CAGGCTTTATTCAA&lt;br /&gt;AGACCA-3&amp;acute;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (5%) and O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (20%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CASY cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile workbench&amp;nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial incubator&amp;nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Analytic Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus for electrophoresis&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel documentation system&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan System&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase-contrast microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

원하는 세포에서 단백질 합성의 유도 합성 메신저 RNA (mRNA의)를 코딩의 외생 배달 재생 의학, 기본적인 세포 생물학, 질병의 치료, 세포의 재 프로그래밍 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 여기서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 유도 된 단백질 발현의 감소 면역 활성화의 가능성과 안정성이 향상, 생산의 mRNA의 품질 관리, 세포의 형질의 mRNA와 검증과 수정의 mRNA의 생성 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. eGFP는 mRNA의 단일 형질 전환 후 3 일까지, 형질 전환 된 HEK293 세포 eGFP는을 생산하고 있습니다. 이 비디오 문서에서, eGFP는 mRNA의 합성을 예로 들어 설명한다. 그러나, 절차는 다른 원하는 mRNA를 생산에 적용될 수있다. mRNA의 변성 합성을 사용하여, 세포를 일시적들이 정상적으로 발현하지 것이다 원하는 단백질을 발현하도록 유도 될 수있다.

eGFP는의 CDS를 포함하여 pcDNA 3.3 플라스미드를 사용하여, 수정 된 eGFP는 mRNA를 합성 (도 1)를 구축했다. PCR에 의한 삽입 증폭 및 폴리 T-미행 한 후, 약 1,100 bp의 길이의 명확한 밴드 (그림 2)을 검출한다. mRNA의 (그림 3)의 수율은 IVT 시간을 증강 증가. IVT 후, 약 1100 bp의 길이의 명확한 mRNA의 밴드가 생성 될 eGFP는 mRNA의 길이 (도 4)에 대응하는 검출되었다...

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In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다.

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.9K 조회수.  University Hospital Tuebingen.  이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다. 

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Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

셀 기반 비 코딩 RNAs 특히 mRNA 번역을 향상 시킬 수 있는 SINEUP의 분석 실험

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

연구

유전학

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

발생학

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic applications, including a novel class of vaccines, protein replacement therapies, and immune therapies. Among delivery vectors, lipid nanoparticles are found to be safer and more effective in delivering RNA molecules (e.g., siRNA, miRNA, mRNA) and a few products are already in clinical use. To demonstrate lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery, we present an optimized protocol for the synthesis of functional me1&#936;-UTP modified eGFP mRNA, the preparation of cationic liposomes, the electrostatic complex formation of mRNA with cationic liposomes, and the evaluation of transfection efficiencies in mammalian cells. The results demonstrate that these modifications efficiently improved the stability of mRNA when delivered with cationic liposomes and increased the eGFP mRNA translation efficiency and stability in mammalian cells. This protocol can be used to synthesize the desired mRNA and transfect with cationic liposomes for target gene expression in mammalian cells.

The protocol presents in vitro transcription (IVT) of chemically modified mRNA, cationic liposome preparation, and functional analysis of liposome enabled mRNA transfections in mammalian cells.

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic ...

생화학

<meta charset="utf8"></head><body>Micro-Compartmentalized Synthetic Cells를 위한 CFPS 프로토콜

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for the core machinery of the Central Dogma, standing as an optimal chassis for the integration and assembly of diverse artificial cellular mimicry systems. Despite its frequent use in the fabrication of synthetic cells, establishing a tailored and robust CFPS system for a specific application remains a nontrivial challenge. In this methods paper, we present a comprehensive protocol for the CFPS system, routinely employed in constructing synthetic cells. This protocol encompasses key stages in the preparation of the CFPS system, including the cell extract, template preparation, and routine expression optimization utilizing a fluorescent reporter protein. Additionally, we show representative results by encapsulating the CFPS system within various micro-compartments, such as monolayer droplets, double-emulsion vesicles, and chambers situated atop supported lipid bilayers. Finally, we elucidate the critical steps and conditions necessary for the successful assembly of these CFPS systems in distinct environments. We expect that our approach will facilitate the establishment of good working practices among various laboratories within the continuously expanding synthetic cell community, thereby accelerating progress in the field of synthetic cell development.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 합성 셀 구축을 위한 CFPS 시스템 최적화

This protocol describes the Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system used in constructing synthetic cells. It outlines key stages with representative results in different micro-compartments. The protocol aims to establish best practices for diverse laboratories in the synthetic cell community, advancing progress in synthetic cell development.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

생체공학

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

생물학

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

면역학 및 감염병학

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Efficient and safe delivery systems must be included in the mRNA vaccines due to the fragile properties of mRNA. A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) gene delivery system is specifically designed for the pulmonary delivery of nucleic acids and displays promising capabilities in mediating successful mRNA transfection. Here, an improved method for preparing PP-sNp is described to elaborate on how the PP-sNp&#160;encapsulates Metridia luciferase (MetLuc) mRNA and successfully transfects cultured cells. MetLuc-mRNA is obtained by an in vitro transcription process from a linear DNA template. A PP-sNp&#160;is produced by mixing synthetic peptide/poloxamine with mRNA solution using a microfluidic mixer, allowing for the self-assembly of PP-sNp. The charge of PP-sNp&#160;is subsequently evaluated by measuring the zeta potential. Meanwhile, the polydispersity and hydrodynamic size of PP-sNp&#160;nanoparticles are measured using dynamic light scattering. The mRNA/PP-sNp nanoparticles are transfected into cultured cells, and supernatants from the cell culture are assayed for luciferase activity. The representative results demonstrate their capacity for in vitro transfection. This protocol may shed light on developing next-generation mRNA vaccine delivery systems.

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) is developed using a microfluidic mixing device to encapsulate and deliver in vitro transcribed messenger RNA. The described mRNA/PP-sNp could efficiently transfect cultured cells in vitro.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

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체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

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합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

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