Name: acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals
Uploaded: 2014-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals at JoVE.c

This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

폴리-D-라이신 브롬화 수소 산염의 1 준비 <ol><li> 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5)에 1 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드를 준비합니다. </li><li> -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. </li></ol> Coverslips는의 2 폴리 라이신 코팅 주 : 층류 챔버 내의 모든 세척 및 코팅 단계를 수행. <ol><li> 2 시간 동안 1 N 염산 (HCL)을 포함하는 페트리 접시에 배치 된 커버. </li><li> 기음 모든 염산 및 70 % 에탄올 (EtOH로) 2 ~ 3 배 씻어. </li><li> 1 시간 동안 70 %의 EtOH에 둡니다. </li><li> 기음은 모두 70 % EtOH로는 100 % EtOH를 2 ~ 3 배 씻어. </li><li> 2 시간 동안 100 %의 EtOH에 둡니다. 모두의 EtOH를 대기음. </li><li> 몇 초 동안 필터 종이와 건조한 공기로 건조시킨다. </li><li> 장소 O / N 일에 mg / ㎖ 폴리 라이신 솔루션입니다. </li><li> 린스는 밀리 포아 물 4-5x와 다음날 된 커버. </li><li> 공기 건조 폴리 라이신 깨끗한 페트리 접시에 유리 롤러에 커버 슬립 코팅. </li><li> immunohistochemistr 들어Y는 35 X 10mm 페트리 접시의 뚜껑을 사용합니다. 0.3 cm의 두께로 접시에 30 ° CO / N로 설정 할 수 있습니다 : 실 가드를 준비 (polydimethylsilioxane, PDMS)는 PDMS (중량 일 엘라스토머 및 에이전트 열 경화) 부어 요리를 지어. 이 설정되면, PDMS로 인세 1cm에서 2cm를 잘라. 커버 슬립에 대해 위에서 언급 한 바와 같은 단계에 따라 폴리 리신과 클린 코트 인셋. </li><li> 스토어 폴리 라이신 코팅 된 커버와 요리 사용까지 (이주까지하지만, 모든 3~4일 주기적으로 준비하여 최선의 접착 결과를 얻을 수) 층류 챔버 내부에 덮여. </li><li> 진동 조직 슬라이서에서 척수를 핀, PDMS 블록을 준비합니다. 믹스 엘라스토머 및 엘라스토머 B 1 : 1 중량. 100 × 15mm 페트리 접시에 붓고 30 ° C에서 O / N을 설정할 수 있습니다. PMDS의 사각형 조각을 잘라 에폭시 접착제를 사용하여 슬라이스베이스 플레이트에 붙입니다. 접착제가 제자리에 고정 PDMS 설정할 수 있도록하고 평면을 얻기 위해 표면에서 다수의 얇은 섹션 슬라이스표면의 조직을 고정합니다. </li></ol> 장어 척수의 3 급성 해리는 고립 된 Reticulospinal 축삭을 얻었다 <ol><li> (100 ㎎ / ℓ MS-222) tricaine의 메테 인설과 ammoecoete 또는 성인 칠성 장어 (Petromyzon의 스 marinus)를 마취. 칠성 장어를 포함, 뚜껑으로 덮여 플라스틱 컵에 물에 마취를 추가하는 희생한다. </li><li> 130 염화나트륨, 염화칼슘, 1.8를 MgCl 2, 4 HEPES, 네 덱스 트로 오스 (산도 7.6, 삼투압이 270 mOsm) 2.1의 KCl, 2.6 제거 본체 : 감기 (4 ° C) (mm 단위) 조성의 링거액에 칠성 장어 목을 벨 벽의 근육은 척수의 등쪽 표면을 노출한다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 척수의 등쪽면에서 meninx의 primitiva를 제거합니다. 이 단계에서 복부 meninx의 primitiva를 제거하지 마십시오. </li><li> 1cm 길이의 조각으로 척수를 잘라. </li><li> PDMS는 기본 괞 찮아를 얇게 줄 지어에, 등쪽면이 위를 향하게 미세 곤충 핀을 사용하여 척수 조각을 핀빙냉 링거액 함유 진동 조직 슬라이서 챔버 내의 TE (2.12 참조). </li><li> 주동이와 꼬리에 그대로 지느러미 열 섹션 뒤에 해리 공정도 2a 및도 2b 동안 처리하는 역할을 종료 떠나 블레이드 rostro - 꼬리 축을 따라 자르는 척수의 등 열의 중앙 부분을 제거합니다. 슬라이스 및 기본 reticulospinal 축삭 열 손상되지 않은 그림 2b를 떠나 만 지느러미 열을 제거하는 깊이 설정을 허용 느린 속도 설정을 사용합니다. </li><li> 1 ㎎ / ㎖ 프로테아제 (스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 유형 XIV)와 링거액에 (클로스 트리 디움 histolyticum에서 유형 IA) 준비 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 칵테일 45 분 동안 실온에서 분리 된 척수 조각을 품어 (엘 Manira &amp; Bussières에서 적응 , 1997 17). </li><li> PDMS에 미세한 핀을 사용 핀 효소 처리 척수 조각은 페트리 접시 conta의 안감ining 감기 (4 ° C에서) 링거액. </li><li> 미세 집게로 복부 meninx의 primitiva를 제거합니다. </li><li> 척수도 차원에서 그대로 reticulospinal 축색 돌기의 중앙 열을 떠나는 슬라이스 지느러미 부분의 중간 지점에 메스 블레이드와 척수의 측면 책자를 잘라. </li><li> 렌즈에 침지 기름 한 방울을 놓습니다. </li><li> 기록 챔버 그림 3의 슬롯에 폴리 라이신 코팅 커버 슬립 (그림 3a, 최고 조각, 빨간색 사각형)을 놓고 실을 용이하게하기 위해, 그림 3a에 빨간색과 파란색 사각형 사이에 (모든 가장자리에 공간을 진공 그리스를 적용합니다. 나사를 제자리에 가기는. 기록 장비의 삽입에 챔버를 놓습니다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 기록 챔버로 링거액을 추가합니다. </li><li> 열전 냉각 소자의 입력 튜브에 부동액을 함유하는 압력 병의 유출 배관을 연결한다. OUTP 연결외부 냉각 재킷의 입력단과 리저버도 3b에 출력 단부에 열전 냉각 소자의 UT 호스. </li><li> 기록 챔버에서 한번에 척수 한장을 넣고 부드럽게 축삭 절연도 2E 및도 2F 전까지 테플론 코팅 된 포셉을 사용하여 항상 커버 슬립을 따라 유지 척수 분리. </li><li> 기록 챔버도 3b의 외측 냉각 자켓을 통해, 열전기 냉각 장치를 통해, (변위) 부동액 가압 (병으로 밀어 질소 가스)를 통과함으로써 10 ° C로 기록 액 온도를 가져온다. </li><li> 축삭은 10 ° C에서 1 시간 후 해리에 복구 할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림이" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; reticulospinal 축삭의 분리를위한 분리 프로토콜의 그림 도식 설명. () 지느러미 열 제거. 화살표는 조직의 슬라이싱의 방향을 나타낸다. 알파벳 V (빨간색 글꼴 색)에 의해 복부 뿔. (b)는 지느러미 열이 reticulospinal 축색 돌기를 노출 척수의 중앙 부분에서 제거하는 동안 등쪽 뿔 (알파벳 D (빨간색 글꼴 색상)에 의해 녹색 선으로 표시된다 ). 슬라이스 처리 후 그대로 유지 복부 뿔이, 알파벳 V (빨간색 글꼴 색)으로 표시됩니다. (C) 단백질 분해 효소와 콜라게나 45 분 치료 칵테일 (1 ㎎ / ㎖)을 효소. 측면 책자의 (d)에 절단 척수; 위치, 방향 및 횡 방향의 절단 정도를 나타낸다. (E) 척수의 기계적 해리. 화살표는 집게와 분리시 분리 힘의 방향의 위치를 나타냅니다. (F) Representati해리 reticulospinal 축삭 준비의 예를했습니다. 녹색 화살표는 시냅스 과정없이 급성 해리 reticulospinal 축삭의 영역을 표시합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> 제공하는 전기 생리학 실험 챔버를 기록 그림 3 도식. 크기는 인치에 있습니다. basepiece 다이어그램 (a)에 도시 붉은 사각형 basepiece에서 커버 슬립 커버 슬립에 홈의 위치를 나타낸다. 높은 진공 그리스가 도포되는 경우 (a) basepiece 다이어그램에 도시 된 적색과 청색 사이의 사각형 영역이다. (b)는 조립 된 기록 챔버를 도시한다. FM 1-43와 4 라벨링과 시냅스 터미널의 식별 <ol><li> V로 FM 1-43을 통합하여, 시냅스 터미널 레이블높은 K + 탈분극 동안 시냅스 엑소 엔도 시토 시스 동안 esicles. (30 밀리미터의 KCl을 포함하는 5 ㎖의 링거액에) 5 μm의 FM 1-43로 준비를 관류. </li><li> 1 밀리그램 준비를 관류 / ㎖ Advasep-7 (5 ㎖의 링거액에) 과잉 FM 염료) (18)를 제거합니다. </li><li> 15 분은 어떤 remant 염료 및 Advasep을 세척하는 링거액과 함께 준비를 관류. </li><li> 표준 형광 이미징 프로토콜을 사용하여 디지털 CCD 카메라와 화상 획득 소프트웨어 그런 경영자와 함께 반전 된 형광 현미경 (100)에 X 오일 침지 렌즈 (NA 1.25)를 가진 이미지. </li><li> 그림 4C 및도 4D를 기록 대상으로 형광 표지 시냅스 터미널을 확인합니다. </li></ol> 고립 된 Reticulospinal 축삭의 5 면역 조직 화학 <ol><li> 가의 이온 (칼슘과 마그네슘 2 +) 무료로 접시 삽입 (프로토콜 부분 2.10.)를 입력링거액. </li><li> P-87 마이크로 피펫 풀러에 패치 피펫을 제작합니다. (실리콘 튜브보기 0.89 mm 흡입 단부에 부착 된 마이크로 피펫 팁 내경 사용) 패치 피펫 (1.5 mm 외경 유리) 및 흡입을 이용하여 폴리 리신 인셋의 일단에 봉합 접착제의 적은 양을 배치. </li><li> 프로토콜 부 (3) 그림 2에서 언급 한 바와 같이. 동일한 절차를 사용하여 dissociations을 수행 표면에 강하게 부착 부드럽게 집게로 봉합 접착제 버튼을 누르세요 척수의 한쪽 끝을 놓습니다. 삽입의 다른 쪽 끝에서 봉합 접착제의 또 다른 드롭을 놓고 부드럽게 축삭이 분해 될 때까지 척추를 스트레칭하고 봉합 접착제 위에 부드럽게 끌어 무료 척수 끝을 준수합니다. 부드러운이 집게로 아래로 눌러 제자리에 고정합니다. </li><li> 환율 2가 관류하여 일반 링거액과 링거액을 확보. </li><li> 축삭은 20 분 후 dissoc에 복​​구 할 수10 ° C에서 iation. </li><li> 20 분 동안 {인산 버퍼 식염수 (PBS, (MM)의 NaCl 137, KCl을 2.7 나 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, 산도 7.4)에서 제조} 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 해리 축삭을 수정합니다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통과하여 사용하기 전에 PFA 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 10 분 동안 (PBS)에 0.1 M 글리신을 관류하여 PFA를 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안 0.1 % (PBS)에 트리톤-X에 품어. </li><li> 20 분 동안 PBS를 관류하여 씻으십시오. </li><li> 4 ℃에서 6 시간 동안 (PBS)에 5 % 무 지방 우유를 차단합니다. </li><li> 관심 VGCC 1 차 항체에 추가 (1 : PBS에서 200 희석)와 4 ℃에서 20 시간 동안 배양한다. </li><li> 20 분 동안 PBS를 관류하여 씻으십시오. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 (PBS)에 5 % 무 지방 우유를 차단합니다. </li><li> 이차 항체에 추가 (1 : PBS에서 400 희석)와 4 ℃에서 2 시간 동안 어둠 속에서 부화. </li><li> 20 분 동안 PBS로 관류하여 씻으십시오. </li><li> 1 % 소 혈청 Albu와 차단20 분 동안 (PBS)에 분. </li><li> 알렉사 플 루어 488 phalloidin에 추가 (작업 농도 μL / 5 단위를 메탄올 200 단위 / ml의 제조 주). </li><li> 20 분 동안 PBS로 관류하여 씻으십시오. </li><li> 공 초점 현미경 100X 물 침지 렌즈를 사용하여 이미지. </li></ol> (6) 전기 생리 녹화 <ol><li> P-87 마이크로 피펫 풀러에서 알루미 노 실리케이트 유리 패치 피펫 (피펫 저항 2-5 MΩ)를 제작합니다. 피펫 팁은 전 시냅스 말단 직경을 포함하도록 설계 패치 피펫. </li><li> PDMS (23)에 50 ~ 60 psi의 압력 하에서 패치 피펫을 침지시킴으로써 PDMS 코팅 패치 피펫 (패치 피펫의 백엔드에 질소 가스 실린더에 접속 된 실리콘 튜브, 0.89 mm의 내경을, 연결) 및 열을 이용한 드라이 총. 대안 적으로, 화합물 현미경 하에서 가능한 팁에 가까운 코팅을 적용 PDMS와 수동 코트 피펫. </li><li> MICR를 사용하여 화재 폴란드어 패치 피펫oforge (복합 현미경의 무대에 장착 된 사용자 지정 내장 된 백금 필라멘트). </li><li> 형광 현미경으로 표시된 시냅스 터미널을 보여 격리 된 축삭을 확인합니다. </li><li> 레코딩 솔루션 작성, 주사기를 사용하여 패치 피펫으로 (칼슘 전류를 차단하도록 설계 전하 캐리어로 10 mM의 염화칼슘이 90 밀리미터 BaCl 2, HEPES pH를 7.6, 삼투압이 270 mOsm 버퍼). </li><li> 전동 조작기의 MP225을 사용하여 목욕 위 피펫 홀더와 위치로 패치 피펫을 삽입합니다. 부드럽게 찬란 확인 시냅스 터미널의 얼굴에 대한 목욕 및 위치로 패치 피펫을 낮 춥니 다. </li><li> 접촉이 막을 될 때까지 천천히 패치 피펫을 진행합니다. 이 시점에서, 피펫 홀더에 부착 된 튜브를 통해 부드러운 입 흡인 기가 옴 시일을 달성한다. </li><li> 를 사용하여, 단일 채널 칼슘 전류를 기록하기 위해 필요한 극히 낮은 배경 잡음 레벨을 달성하기 위해,레코딩을위한 냉각 headstage와 xopatch (200B). 5 kHz의 베셀 필터를 사용하여 20 ~ 50 kHz 및 필터의 샘플 데이터입니다. X. Axograph를 이용하여 데이터 수집을 수행 </li><li> 자극 (10)과 같은 MV 증분 단계 표준 프로토콜을 사용한다. 칼슘 채널의 활성을 최대 보장하기 위해, 단계 프로토콜에 선행, 프로토콜 프리 펄스를 통합한다. 누설 전류의 사후 분석 감산하는 단계 프로토콜에 10 MV 누설 단계를 통합. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

우리의 해리 프로토콜은 시냅스 돌기도 2 층의없는 격리 된 reticulospinal 축색 돌기를 산출하여 중요하지만, 그럼에도 불구하고 기능적인 시냅스 단자도 4C 및도 4d를 유지한다. 시냅스 말단 대향 시냅스 프로세스의 부재는 이전, 중앙 시냅스 가능한 성공적 두 calyceal 연접 형 터미널에서 달성되지 단일 시냅스 말단에 연접 박리 얼굴 막에 직접 기록 액세스를 허용한다; 병아?...

시냅스 전달은 매우 신속하고 정확한 과정이다. 시냅스 터미널의 활동 전위 침공 릴리스 얼굴 막, 연접 칼슘의 결과 증가 2 + 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출 하나의 트리거 역할에있는 VGCCs의 개방에 연결됩니다. 이러한 모든 단계는 마이크로이 수백 내에서 발생하고, 따라서 소포 융합 기계 3 VGCCs의 꽉 공간 커플 링을 필요로한다. 시냅스 칼슘 이온 플럭스는 주로 칼슘에 민감한 염료 사를 사용하여 접근 방법 영상을 특징으로하고있다. 시냅스 전 뉴런에서 칼슘을 혼입 변조 칼슘 버퍼 간접적 시냅스 신경 전달 칼슘과 3 사이의 관계를 특성화하는 데 사용되어왔다. 또한, 칼슘 5 uncaging 또는 macroscopi을 기록하여 시냅스 무료 칼슘 농도를 조절칼슘 2 + c를 전류 소포 융합 및 / 또는 방출의 측정과 관련하여 사용되었다; 이러한 정전 용량을 측정으로 6 시냅스 응답은 같은 질문을 해결하기 위해 2. 시냅스 소포의 융합과 신경 전달 물질의 방출을 유발 2 + 전류 그러나, 릴리스 얼굴 2 + 전류를 직접 칼슘의 특성, 막 탈분극이 캘리포니아로 번역 된 시냅스 막의 전문 섹션은 칼슘의 정확한 측정을 얻기에 필수적이다 2 + 시냅스 소포의 융합에 대한 요구 사항. 게다가, 능력이 직접 활동 전위의 시간 경과 간의 타이밍 관계의 정확한 해명이 소포 융합 및 릴리스 정확한 동시 측정을 가능 결합 개별 시냅스 말단에 칼슘 이온 전류의 특성을, 연접 칼슘 전류 소포의 융합 및 릴리스. 릴리스 얼굴 막에 대한 액세스시냅스 돌기에 의해 동격를 닫 인해 시냅스 터미널의 대부분에서 사용할 수 없습니다. 그것은 개별 시냅스 터미널에서 전류의 직접 측정을 방지 때문에 어려움은 VGCCs의 특성에 큰 장애물이되고있다. 개별 시냅스 터미널에서 시냅스 칼슘 전류의 직접 특성은 지금까지 중앙 시냅스 가능되지 않았으므로 및이 calyceal 형 시냅스 터미널에서 달성되었습니다; 병아리 섬모 신경절 7-10 쥐 꽃받침 11, 12의 꽃받침 형 시냅스. 심고 척수 13 거 reticulospinal 시냅스 포함한 모든 다른 시냅스 단자에서 시냅스 전 방출면 막에 대한 액세스의 부족은 시냅스 칼슘 플럭스 공부 칼슘 촬상 간접 방식의 사용을 필요로했다. <img alt="그림 1" f오 : 콘텐츠 너비 = &quot;5 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,925 / 51925fig1highres.jpg&quot;너비 = &quot;500&quot;/&gt; dorso - 복부 방향을 나타내는 칠성 장어의 척수의 그림 1 장어 거대한 reticulospinal 시냅스. () 단면. Reticulospinal 축삭 녹색 별표로 표시되어 있습니다. 시냅스 후 뉴런 (13) 상 (녹색 화살표로 표시) 시냅스 reticulospinal 축삭 옆모습 연락처 엔 수많은 결정을 보여주는 칠성 장어의 척수 reticulospinal 시냅스의 (b)는 3-D 재건. 시냅스 후 뉴런이 알렉사 플 루어 568 하이 드라 지드 (적색)로 가득하고있는 동안 시냅스 터미널, 알렉사 플 루어 488 하이 드라 지드 복합 phalloidin (녹색)으로 표시되어있다. 의 신경 세포에 옆모습 연접 엔 척추 주동이의 - 꼬리 축 그림 1a에 코드 병렬 형태의 다중의 복부 지역에 위치한 칠성 장어 거인 reticulospinal 축삭,척추 복부 혼 (14) 그림 1b 13. 육안 전체 세포 칼슘 전류는 그대로 척수 (13, 15)에 reticulospinal 축삭에서 기록되었다. 그러나, 칼슘의 직접 측정에서 이전 블라인드 시도는 세포 부착 패치 클램프 기술을 이용하여 그대로 심고 척수 reticulospinal 축삭에서 2 + 전류 인해 대향 시냅스 프로세스에 의해 시냅스 전 방출면 막 액세스 부족 13 실패 입증 그림 1b. 릴리스 얼굴 막은 이전에, 시냅스의 기계적 교란 전에 12를 기록, 기계적 해리 (16)와 결합 효소 처리 시냅스 후 뉴런 (11)의 제거에 의해 액세스 가능하게되었습니다. 척수의 복합 조직 감안할 때 시냅스 후 뉴런을 식별하고 그것을 기계적으로 후퇴 또는 일을 교란하는 것은 매우 어려울 것이다전자 시냅스. 따라서, 우리는 기계 해리 다음 효소 처리 (17)를 사용하기로 결정했다. 이 방법을 사용하여, 우리는 이에 개별 시냅스 터미널에 대한 무제한 액세스를 제공하는 시냅스 프로세스의없는 기능 시냅스 터미널 가능한 격리 reticulospinal 축색 돌기를 산출 칠성 장어의 척수의 급성 해리 준비를 개발했다. 표준 도립 현미경 및 형광 이미징과 결합에서, 세포 -을 사용하여 기록, 칼슘 이온 전류도 4C 및도 4D를 분리하는 기록 액을 함유하는 패치 피펫, 식별 및 개별 형광 식별 된 시냅스 전 단말을 대상으로 미국있게 연결된 전압 클램프 기법. 칼슘 전류는 개별 시냅스 터미널 그림 4 층의 시냅스 릴리스 얼굴 막에 직접 기록하고있다. 이 significa입니다그것이 중앙 시냅스에서 수행되는 최초의 기록이기 때문에 NT 시냅스 전달의 필드 돌파구.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

시냅스 전달은 매우 빠른 과정이다. 활동 전위가 릴리스 얼굴 막에있는 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCCs)을 통해 시냅스 터미널에 칼슘의 유입을 주도, 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출을위한 트리거이다. 시냅스 전달의 신속성에 중요 활동 전위, VGCCs의 도착과 신경 전달 물질 방출 기계 사이의 공간적 시간적 동시성이다. 직접 칼슘 개별적인 시냅스 단자 분리면에서 막 2 + 전류를 기록 할 수있는 능력은 시냅스 전 칼슘과 신경 전달 물질의 방출 사이의 관계를 정확하게 이해하는데 필수적이다. 전기 생리 학적 기록에 대한 시냅스 릴리스 얼굴 막에 대한 액세스는 대부분의 준비 및 연접 칼슘에서 사용할 수 없습니다 2 + 항목은 이미징 기술과 거시적 현재의 방식 측정을 사용하는 것을 특징으로하고있다국세청 - 칼슘 항목을 시각화 할 수있는 충분한 시간 분해능이없는 기술. 직접 하나의 시냅스 터미널에서 VGCCs의 특성은 중앙 시냅스에서 가능하지 않았다 및 지금까지 성공적으로 만 병아리 섬모 신경절의 꽃받침 형 시냅스와 쥐 꽃받침에 달성되었다. 우리는 성공적으로 시냅스 구조의 결여 기능 시냅스 단자를 절연 reticulospinal 축색 돌기를 산출 척수의 급성 해리 준비를 개발하여 칠성 장어의 척수의 거대한 reticulospinal 시냅스에서이 문제를 해결했다. 우리는 찬란 레이블 및 개별 시냅스 터미널을 확인하고 녹화를 타겟팅 할 수 있습니다. 이 혼합물을 사용하여, 우리는 면역 조직 화학 및 전기 생리학 접근 방식을 사용하여 개별 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴을 직접 VGCCs을 특징으로하고 있습니다. 칼슘 전류는 릴리스 얼굴 막 O를 직접 기록 된F 시냅스 개별 단말들은, 최초의 기록은 중앙 시냅스에서 행할 수있다.

<html> 이 해리 프로토콜 수익률 건강하고 기능적인 절연 reticulospinal 시냅스 돌기도 2 층의 결여 된 축삭, 그럼에도 불구하고 유발 시냅스 소포 엑소와 엔도 시토 시스의 그림 4C 및도 4D 할 수있는 기능 시냅스 터미널을 유지합니다. reticulospinal 축삭의 고립 된 지역의 섹션은 명확하게 reticulospinal 축삭 막 그림 2 층에 대한 무제한 액세스를 허용하는 다른 신경 프?...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

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Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

크레이 레그 신근 근육에 높은 및 낮은 출력 NMJs의 생리 레코딩

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

연구

신경과학

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

생물학

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Source: Hellmer, C. B., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52422">Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Experimental ...

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

크레이 레그 신근 근육에 높은 및 낮은 출력 NMJs의 생리 레코딩

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

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크레이 레그 신근 근육에 높은 및 낮은 출력 NMJs의 생리 레코딩

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 + 영상

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}