Name: preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

다음 프로토콜은 동물 관리의 캐나다 협의회의 가이드 라인을 준수하고 토론토 대학에서 의학 및 약학 동물 관리위원회의 교수진에 의해 승인되었습니다. 표 1에서 설명한 것과 같이 필요한 시약을 준비 <ol><li> 표 1에 설명 된 농도에서 모두 자당 솔루션, 버퍼에 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 (필요한 경우) 억제제를 추가하고 DDH 2 O. 중요 : 실험의 시작하기 전에 시약 및 장비를 모두 4 ° C에서 모든 단계를 수행하고 사전 멋진. 영구 마커 초 원심 분리기 튜브를 포함한 모든 튜브 레이블. </li></ol> 적절한 두뇌 지역의 2 해부 <ol><li> 자궁 경부 전위 또는 잘린 동물을 제물로 바친다. 하우스와는 동물 보호에 대한 제도 및 정부 정책에 따라 동물을 안락사. </li><li> 신속하게 일을 제거냉장 해부 블록에 두개골과 장소에서 전자 두뇌입니다. </li><li> 신선한 조직에서 해당 뇌 영역을 해부하고 3 단계로 진행합니다. </li></ol> 모터 구동 유리 테플론 균질와 3 조직의 균질화 <ol><li> 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액 4ml를 포함하는 레이블 13 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 해부 조직 (SPM 용) 50 ~ 100 ㎎, 또는 (PSD 용) 100 ~ 200 mg의 놓습니다. 15 ㎖의 테이퍼 유리 - 테플론 조직 그라인더 / 균질화에 샘플을 이동시켜, 900 RPM (7 설정) 모터 드라이브를 설정하고 30 초에 걸쳐 12 스트로크 샘플을 균질화. 샘플 사이에 다른 유리 테플론 균질화를 사용하거나 샘플 사이의 차가운 증류수로 균질화를 씻어 킴으로 물기를 닦아냅니다. NOTE : 조직 4g 최대 그러나 그것은 적절한 분획을 확인하기 위해 이하의 조직을 사용하는 것이 바람직하다, 0.32 M 수크로오스 HEPES 완충 용액 4 ㎖에 균질화 될 수있다. </li><li> t 다시 균질화 샘플을 전송같은 13 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브 오. 이사회 이후의 단백질 정량 및 총 단백질 분획의 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 파​​쇄 및 저장 100 ㎕. </li></ol> 4 저속 원심 분리가 핵 분획을 제거하는 (금리 뜨는 S1) <ol><li> 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 900 XG에 고정 각 회 전자의 균질. 새에 뜨는 (S1)을 전송, 13 ML 튜브를 표시하고 0.32 M HEPES 버퍼 자당의 500 μL에 핵 분수 펠렛 (P1)을 재현 탁. NOTE : (P1) 분획은 -80 ° C에 보관과 핵 분획의 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용될 수있다. </li></ol> 원유 Synaptosomal 분수의 5 농축 (수익률 펠렛 P2) <ol><li> 4 ° C에서 15 분 동안 10,000 XG에 뜨는 (S1)을 원심 분리기. microcentrifuge 관에 500 ㎕의 후속 단백질 정량을위한 -80 ° C에서 저장하는 상층 액 (S2)와 예약을 제거동북 아시아의 평화와 번영과 세포질 / 라이트 막 분획의 서양 얼룩 분석. 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액 1 ㎖에 남아있는 원유 synaptosomal 분율 펠렛 (P2)을 재현 탁하고 또 다른 3 ㎖의 0.32의 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 10,000 × g으로 원심 분리기. 이후 단백질 정량 및 세포질 / 라이트 막 분획의 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 저장하는 microcentrifuge 관에 뜨는 (S2 &#39;) 및 예비 500 μl를 제거합니다. 폴리 프로필렌 튜브에 세척 조 synaptosomal 펠렛 (P2 &#39;)을 저장합니다. </li></ol> 원유 Synaptosomal 분수의 6 용균 (Hypoosmotic 충격) <ol><li> DDH 2 O. 1 ㎖에 재현 탁을하여 폴리 프로필렌 튜브를 Lyse 조질 synaptosomal 펠렛 (P2 &#39;) DDH 2 O의 또 다른 3 ㎖를, 3 선을 손으로 유리 테플론 조직 균질로 전송하고, 균질화 추가합니다. 참고 : 그것은 중요빨리 가능한 빨리이 단계를 수행하고 6.2 단계로 진행합니다. </li><li> 다시 동일한 13 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 빠르게 균질로부터 전송 샘플을, 1 M HEPES 용액 16 μL로 다시 4 mM의 HEPES으로 샘플을 조정 혼합 반전. </li><li> 30 분 완료 용균을 보장하기 위해 4 ° C에서 샘플을 돌립니다. </li></ol> Synaptosomal 막 분수의 7 농축 (P3) <ol><li> 4 ° C에서 20 분 동안 25,000 × g으로 원심 분리기. 조 기공 분수 상층 액 (S3)를 제거하고 이후의 단백질 정량 및 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 저장하는 5 ML 튜브에를 보유합니다. 0.32 M 수크로오스 HEPES 완충 용액 1 ㎖에 synaptosomal 세포막 분획 (P3)에 재현 탁. </li></ol> 불연속 자당 그라데이션의 8 준비 <ol><li> 피펫 정확히 3.5 ml의 1.2 M HEPES 버퍼 자당 용액 정확히 3.0 ㎖의 각 1.0 M 0.8 M HEPE의별도의 6 ML에 S-버퍼 자당 솔루션은 캡 튜브 웁니다. 참고 :이이 자당 기울기를 확인하는 데 사용되는 버퍼의 양을 미리 측정하기 위해 수행됩니다. 볼륨의 정확한 측정 결과 그라데이션 초 원심 분리에 대한 균형 될 수 있도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 및 전구를 사용하여 12 ㎖의 polyallomer 초 원심 분리기 튜브에 1.2 M HEPES 완충 수크로오스 용액을 전송. 조심스럽게 1.2 M HEPES 버퍼 자당 솔루션의 상단에 1.0 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 층. 마지막으로, 1.0 M HEPES 버퍼 자당 솔루션의 상단에 0.8 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 층. 각 자당 솔루션에 대한 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하고 자당 기울기를 방해하지 않도록주의. 벤치 소용돌이 또는 마이크로 원심에서 진동은 그라데이션의 무결성을 방해 할 것이다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 이용하여 제조 된 불연속 자당 구배 상단에 재현 탁 synaptosomal 세포막 분획 (P3)를 층.그라디언트가 스윙 버킷 로터의 버킷 내부를 무게로 균형되어 있는지 확인합니다. 버킷 균형을하지 않은 경우, 조심스럽게 로터 버킷 그라데이션의 상단에 0.32 M HEPES 버퍼 자당을 추가하고 균형 P200 피펫을 사용합니다. </li></ol> 시냅틱 플라즈마 멤브레인의 9 분별 (SPM) <ol><li> 4 ° C에서 2 시간 동안 150,000 XG에 스윙 버킷 로터에서 초 원심 분리기. 조심스럽게 초 원심 분리기의 버킷에서 자당 구배를 제거합니다. 18 G 바늘과 1 ㎖의 주사기를 사용하여, 1.0 M / 1.2 M HEPES 완충 자당 용액의 계면의 하단에 튜브를 천공하고 시냅스 세포막 층 (SPM)을 철회. </li><li> 각 SPM 샘플 1 ML의 주사기에서 차지하는 부피를 기록합니다. 각 샘플이 조정되면 정확히 4 mM의 HEPES의 2.5 볼륨이 0.32 M.에 1.2 M의 자당 농도를 조정 추가, 3.5 ml의 두꺼운 벽 초 원심 분리기 튜브에 수집 된 SPM 층을 배치에드는 0.32 M 자당에, 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액으로 튜브를 균형. </li><li> 4 ° C에서 30 분 동안 200,000 XG에 고정 각 회 전자의 초 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다. 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 300 μL에 시냅스 세포막 펠릿 (SPM)을 재현 탁. -80 ° C에서 보관 샘플 서부 블로 팅에 사용되는 때까지. </li></ol> 시냅스 밀도 분획 (10) 제조 (PSD) <ol><li> 얼음에 SPM 샘플을 해동. </li><li> 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 0.54 % 트리톤 X-100 용액을 확인. </li><li> 5 ㎖의 폴리스티렌 관에서 트리톤 X-100 / HEPES / EDTA 용액 300 ㎕의 SPM 분율 2.7 ML을 결합하고 4 ° C에서 15 분 동안 샘플을 회전 </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 32,000 XG에 3.5 ㎖의 두꺼운 벽 초 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 샘플로 전송 샘플. </li><li> -80에서 뜨는 (트리톤 X-100, 가용 분 [TS]) 및 저장을 예약; C를 °. 주 :이 단계에서는, 펠릿 &quot;PSD-1T&quot;분획을 나타낸다. 세제 초 처리는 &quot;PSD-2T&quot;부분을 생성합니다. PSD-1T 분율을 원하는 경우, 10.6 단계로 진행합니다. <ol><li> PSD-2T 분획을 생산하기 위해, 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 3 ㎖의 0.5 %의 트리톤 X에 펠릿을 재현 탁-100. 4 ° C에서 15 분 동안 샘플을 돌립니다. 4 ° C에서 20 분 동안 32,000 XG에 원심 분리기 샘플 및 10.6 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 뜨는을 취소하고 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액에 시냅스 (PSD) 펠렛을 재현 탁. NOTE : 재 부유 볼륨 펠릿의 크기에 의존 할 수있다; 50 ~ 75 μL의 볼륨을 권장합니다. PSD 분획 세제 불용 분획이기 때문에, 단백질의 완전한 재 부유 있도록 0.5 % SDS 1-2 μL를 추가하는 것이 필요하다. -80 ° C에서 보관 샘플 서부 블로 팅에 사용되는 때까지. </li></ol>

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E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

성공적인 결과를위한 중요한 절차의 몇 가지 단계가 있습니다. 단계 3에서는, 균질화의 일관성 정도가 각각의 샘플에 대해 달성되는 것이 중요하다. 구동 모터와 균질 조직을 균질화 할 때 일정한 속도 유봉의 회전뿐만 아니라, 스트로크의 수뿐만 아니라 사용된다. 저장성 용액 확장 균질화 또는 배양이 미토콘드리아를 용해하고 SPM 샘플을 오염 때문에 삼투압 충격 동안 배양 시간은 정확해야한?...

뉴런은 시냅스를 통해 통신하고,이 통신 품질이 시냅스에서 단백질 조성물의 변화가 큰 범위로 조절된다. 특히, 시냅스 후 밀도에있는 단백질은 신호 전달 체계 1 속속들이 비계 신경 전달 물질 수용체의 연결에 의해 통신에 참여한다. 또한 시냅스 효능의 강도 변화는 지속 시냅스 후 밀도 1-6에서 추가 또는 수용체의 제거에 의해 제어된다. 따라서 시냅스 단백질의 분리 및 정량은 신경 자극과 시냅스 효능 7을 변경하는 대응 방법에 대한 통찰력을 얻을 수있는 필요하고 유용한 기술이다. 이 문서에서는 불연속 자당 그라디언트에 초 원심 분리에 의해 쥐 뇌 조직에서 시냅스 단백질을 분리하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 시냅스 세포막 분획을 농축 할 수 있고 기반 절연경험적 1.2 M 수크로오스 유사한 것으로 판정 된 수크로오스의 밀도. 생물학적 질문에 따라 세포 내 분획 자당 또는 퍼콜 하나의 연속 또는 불연속 그라디언트에 의해 분리 될 수있다. 연속 그라디언트 여러 분획으로 단백질의 분리를 허용; 이 주어진 분수 8 내에서 단백질의 공동 현지화을 설명하기 위해 특히 유용 할 수 있습니다. 그러나, 연속 그라디언트의 준비는 더 힘든이며 많은 응용 프로그램에 필요하지 않습니다. 불연속 구배가 비교적 쉽게 제조 할 수 있으며, 몇 일반적으로 정의 된 단백질 분획을 분리하는 데 사용될 수있다. 증가 몰 농도의 수크로오스 세 층으로 구성되는 불연속 구배 널리 시냅스 원형질막 (SPM)과 연관된 단백질을 분리하는데 사용되어왔다. 이 시냅스 세포막 분획을 상기 시냅스 후 밀도 fractio로 처리 될 수있다세제 불용성 부분의 세제 처리 및 분리에 의해 N (PSD). 이 프로세스가 첫번째 1960 9,10에서 설명 될 때, 전자 현미경은 대략 시냅스 세포막과 시냅스 후 밀도 분획 9-14을 정의하는 소기관 및 세포막을 입증하기 위해 사용되었다. 이러한 연구들은 전후 시냅스 막 및 SPM 분획 시냅스 소포의 포함을 증명; 세제 치료를 주로 전자 조밀 한 후, 시냅스 밀도를 볼 수 있었다. 절차에서, 저장성 충격 전지 본체 (10)로부터 시냅스 핀치 오프 공정을 위해 사용된다. 이 단계는 미토콘드리아는 삼투압 충격에 더 저항성을 그대로 유지하고, 그래서 그들은 자당 구배 (도 1)의 바닥에 침강한다는 사실을 이용한다. 이 같은 농축 기술을 사용하여, SPM 및 PSD 분수 생화학 첫번째이었다폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 및 주요 단백질 성분 15-17의 서열에 의해 정의. 그 후 서양 얼룩 분석 (그림 2)이 분수를 정의 더 감지하고 시냅스 단백질의 수준을 정량화하는 데 사용되었습니다. 우리는 Slc6a3 궤적 쥐 18에서 중복 될 때 발생하는 도파민 수송의 시냅스 수준의 변화를 정량화하기 위해 실험실에서이 기술을 사용하고 있습니다. 우리는 또한 DISC1의 interactome 19의 일부 단백질이 시냅스 별 감축을 발견하는 NMDA 수용체 결핍 생쥐에서이 기술을 사용하고 있습니다. 또한 SPM 획분 시냅스 소포 막 단백질, 엔도 좀 마커, 미토콘드리아 단백질, 막 관련된 합성 효소 및 신호 전달 분자뿐만 아니라, 시냅스 후 밀도의 적분 요소 및 시냅스 세포막 (20-23)를 포함하는 웨스턴 블롯 분석으로부터 명백하다. E하지마 PSD 풍부한 분획 미토콘드리아 단백질 오염을 가질 수 있으며이를 제거하기 위해 13 초 구배 침강 또는 추가적인 정제 단계를 수행 할 필요가있다. 최근 정량적 질량 분석은 단독 시냅스 후 밀도의 100 위에 단백질의리스트뿐만 아니라, 이들 구성 요소 (24, 25)의 상대적인 풍요의 표시를 제공하고있다.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

신경 세포 내 분획 기술과 시냅스에서 인신 매매 단백질의 정량화 할 수 있습니다. 원래는 1960 년대 후반에 설명한 바와 같이, 시냅스 세포막과 연관된 단백질 자당 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 단리 될 수있다. 시냅스 막 단리되면 시냅스 후 밀도로 알려진 고분자 복합체이어서 인해 세제 불용성으로 분리 될 수있다. 시냅스 세포막과 시냅스 후 밀도 단백질을 분리하는 데 사용되는 기술들은 본질적으로 사십년 후 동일하게 유지하고, 현재 널리 신경 과학 연구에 사용된다. 이 문서에서는 시냅스 세포막과 시냅스 밀도가 불연속 자당 기울기 사용과 관련된 단백질의 분별에 대해 자세히 설명합니다. 그 결과 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다.

자당 밀도 구배의 제제는 수 크로스 (0.8, 1.0 및 1.2 M 수크로오스)의 세 몰 솔루션이 완전히 분리 될 것이다. 단백질 샘플이 추가되기 전에 그라데이션의 예는도 3a를 참조하십시오. 구배 미리 너무 제조하거나, 다른 기기로부터 진동 벤치 표면에 제조 된 경우, 구배는 손상 될 것이며, 적절한 분리가 달성 될 수없는 경우. 세 용액의 명확한 분리가 보이지 않는 경우, 단백질 시료를 추가?...

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Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

이 문서에서는 불연속 자당 기울기에 초 원심 분리에 의해 시냅스 세포막과 관련된 단백질의 농축을 자세히 설명합니다. 시냅스 밀도 단백질의 준비 과정도 설명한다. 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다.

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K 조회수.  University of Toronto.  이 문서에서는 불연속 자당 기울기에 초 원심 분리에 의해 시냅스 세포막과 관련된 단백질의 농축을 자세히 설명합니다. 시냅스 밀도 단백질의 준비 과정도 설명한다. 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다. 

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

연구

생화학

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

신경과학

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

미토콘드리아 접촉 부위의 분리

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 접촉 부위 및 아키텍처 인사이트 공개 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

요약

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미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

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