우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.

본 연구에 사용 된 동물은 캐나다에 의해 설명 된대로 국가 표준을 다음과 동물의 보호를위한 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 4 대학 몬트리올 (CRCHUM) 기관위원회의 승인 프로토콜 (N08001CVsr)에 따라 엄격하게 처리하여, 동물 관리 협의회 (CCAC). 이 프로토콜 (표 1)을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 준비합니다. 장비, 소모품 및 공급 업체에 대한 다른 모든 세부 사항은 재료의 목록에서 찾을 수 있습니다. <img alt="표 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> 표 1 버퍼 조성물은. 쥐 척수의 1 컬렉션 <ol><li> 깊이 4 % isoflorane와 쥐 (스프 라그)를 마취시키다. 일의 곤란에 반사의 부족에 의해 진통제를 확인전자 앞발. 단두대를 통해 잘린 쥐를 안락사. 안락사이 방법은 척수 왜곡이있는 다른 사람들보다 더 선호된다. </li><li> 척추를 노출 뒤의 피부를 잘라. 다만 골반 뼈 위의 뼈 가위로 척추를 잘라. 척주의 개통을 시각화. </li><li> 척추에, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 채워진 200 μL 피펫 팁 (불꽃을 통해 약간 녹는 통해 부착)로, 10 ML의 주사기를 삽입합니다. </li><li> 플런저 압력의 매체 량을 적용하여 척수 세척. </li><li> 모든 혈액 척수에 존재하는 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 PBS로 헹군다. 참고 :이 방법은 또한 뇌와 간을 위해 검증되었습니다. 이러한 조직을 포함하는 경우, 절반 안락사 래트에서 뇌 및 척수에서 동일 간 중량의 조각을 모은다. 다른 모든 단계는 동일 남아있다. </li></ol> 척수에 Mit의 2 절연ochondria (반데 Velde 외 각색. 4) <ol><li> 5 볼륨 (~ 3.25 ml)에 균질화 버퍼 (HB) 5 ㎖의 유리 균질의 전체 손상 척수과 장소를 수집합니다. 격리 된 미토콘드리아의 최적의 복구의 경우, 얼음 또는 차가운 방에서 모든 단계를 수행합니다. 조직의 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 손으로 약 8 스트로크를 조직을 균질화. 둘 (2 ㎖) 또는 셋 (1.7 ml)에 마이크로 원심 튜브에 균질를 놓습니다. 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리기 1300 XG. </li><li> 5 ML의 초 원심 분리기 튜브에 상층 액과 장소를 복구 할 수 있습니다. 펠릿 함유 microcentrifuge 관에 750 μL (~ 0.5 권) HB를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하고 재 부상은 두 번 더 반복합니다. 위의 수영장 같은 5 ML의 초원 심 분리기 튜브에 모든 상층 액 (S1A 및 S1B). 이 단계는 작은 파편을 제거하는 역할을한다. </li><li> 원심 분리기는 S1이 스윙 버킷 부패가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 풀링또는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 세포질 분획 (웨스턴 블롯 분석을위한 예를 들어) 관심사 인 경우 추가 처리를 위해 상등액 (S2)를 유지한다. 4 ML의 HB + 50 mM의 KCl을 펠릿에 (P2), 조 미토콘드리아 분획을 재현 탁. 스윙 버킷 로터에서 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 17,000 XG. 뜨는을 취소하고 부드럽게 800 μL의 HB에서 펠렛 (P3)을 재현 탁. NOTE : 미토콘드리아 어떤 비특이적 미토콘드리아 관련 오염 물질을 제거하기 위해 HB + 50 mM의 KCl을로 세정된다. </li><li> 새로운 5 ㎖의 초 원심 분리기 튜브에서 재 부유 펠렛 (P3)의 정확히 800 μl를 추가합니다. </li><li> 이에 의해이 튜브에 12 % Iodixanol의 최종 농도를 만들어, Iodixanol (밀도 구배 배지) 200 μl를 추가한다. 온화하지만, 철저 P1000 피펫을 통해 함께 튜브의 내용물을 혼합한다. 제 Iodixanol 첨가하고 재현 탁 펠릿 (P3)의 철저한 혼합을 촉진하는 것이 바람직 할 수있다. ULT에서 원심 분리기4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에서 스윙 버킷 로터가 장착 racentrifuge. </li><li> NOTE : 간이 미엘린을 제공하지 않으며, 단지 간 처리되는 경우에는, 따라서이 단계는 필요하지 않다. CNS 간 미토콘드리아와 동시에 처리되는 경우, 그것은 동일하게 모든 조직을 치료하는 것을 권장한다. </li><li> 튜브의 상단에 미엘린의 레이어를 대기음 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛이 느슨 할 수 있습니다. 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 4 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에. 뜨는을 취소하고 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 ~ 200 μL의 HB에 최종 펠릿 (P7)을 재현 탁하고, 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플은 격리 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. </li><li> 단백질 정량 진행합니다. 미토콘드리아 두리의 충분한 용해를 보장하기 위해 샘플 및 2 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)의 표준 곡선을 희석NG 단백질 정량. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대 한 격리 된 미토콘드리아의 3 Immunolabeling <ol><li> 각 염색 믹스를 테스트하기 위해서는, 피펫 1.7 ML microcentrifuge 관에 고립 된 미토콘드리아의 25 μg. 각 실험에서 흠없는 샘플을 포함; 각 항체에 대한 적절한 이소 타입 제어를위한 샘플을 포함해야합니다. </li><li> 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 4 ° C (차단 단계)에서 15 분 동안 10 % 지방산 무료 BSA와 보충 50 ㎕의 미토콘드리아 버퍼 (M 버퍼)에 격리 된 미토콘드리아를 재현 탁. 참고 : 라벨 동안 4 ° C에서 냉장고에 인큐베이션을 수행합니다. </li><li> 튜브에 차 항체 (토끼 항 Mfn2, ML 당 20 μg)을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 참고 : 적정에 의해 경험적으로 각 항체의 최적 농도를 결정합니다. 집중력 및 / 또는 P의 변동urity, 동일한 제조업체의 같은 항체의 다른 많은 다른 결과가 발생할 수 있습니다; 따라서 적정 항체의 새 많이 필요합니다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 부드럽게 200 μL M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 튜브에 차 항체 (당나귀 항 - 토끼 IgG의 피코 에리 트린 (PE) ML 당 0.5 μg)을 추가하고 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분, 위해 샘플을 배양한다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 200 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 500 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 이벤트가 사실 미토콘드리아에있는 보장하기 위해,와 얼룩 고립 미토콘드리아빛으로부터 보호 RT에서 15 분 동안 미토콘드리아 특정 형광 염료. 다른 기능 매개 변수 (미토콘드리아 막 횡단 전위 또는 슈퍼 옥사이드 생산)의 염색이 필요한 경우가 아닌 경우, 수집을 위해 5 단계로 진행 4 단계로 진행합니다. 참고 :이 차 항체의 발광 스펙트럼은 기능 염료의와 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. (: 예 650 내지 / 엠 660 nm의 APC)를 예를 들어, 테트라 메틸 메틸 에스테르 (TMRM)와 FITC 및 횡단 전위 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 상용 염료 미토콘드리아 순도를 확인하는 경우, 가능한 이차 항체 알로 피코된다. 보상 컨트롤을 추가, 즉, 샘플 immunolabeled 또는 적용 할 때 하나의 형광 물질로 염색. </li><li> 사이토로드 흐름에 적합한 튜브에 전송합니다. (. 작은 샘플 크기, 미세 적정 튜브 ML 튜브의 유동 세포 계측기 (3) 내부에 배치를 용이하게하기 위해) 얼음에 샘플을 유지하고 즉시 진행취득 흐름 cytometer. </li></ol> 4 시금 미토콘드리아 막 횡단 잠재력 및 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아 과산화물 생산 <ol><li> 격리 된 미토콘드리아가 빛으로부터 보호 실온에서 15 분, 대한, 단계 3.8에서, 100 nm의 TMRM (예 548 nm의 / 엠 574 nm의) 오 염색하여 그대로 횡단 잠재력을 가지고 있는지 확인합니다. 샘플 및 인구, TMRM (1-30 nm의)의 상 / 비 담금질 농도의 사용 사이 횡단 잠재력의 비교를 위해, 6 더 적합 할 수있다. <ol><li> TMRM 염색법, 100 μM 카르 보닐 시아 나이드 m-클로로 페닐 하이드라진 (CCCP)의 존재하에 100 nM의 TMRM 가진 얼룩 절연 미토콘드리아 미토콘드리아 탈분극 것이다 미토콘드리아 uncoupler 대 대조군. 낮은 농도의 염료가 사용되는 경우 미토콘드리아 탈분극 필요 CCCP의 농도는 작을 수있다. </li></ol></li><li> 격리 된 미토콘드리아가 성하여 미토콘드리아 과산화물을 생성되었는지 확인빛으로부터 보호 RT에서 15 분에 대해, 또한 단계 3.8에서, 적합한 미토콘드리아 과산화물 표시기 7 aining. <ol><li> 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생산, 10 μM Antimycin A, 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생성을 보강한다 호흡 연쇄의 복합체 III의 억제제의 존재 하에서 염료 얼룩 절연 미토콘드리아 대 대조군. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아를 고립 Immunolabeled의 5 수집 및 분석 <ol><li> 악기 설정 : 선형에서 스위치 전압 절연 미토콘드리아 및 설정 전압의 분석을 용이하게하기 위해 모드를 기록 (FSC : 450, SSC : 250). 이벤트가 FSC-A (영역) 모드뿐만 아니라 FSC-W (폭) 및 FSC-H (높이)에 수집되어 있는지 확인, 이중선을 (배제 할 수 있어야합니다 즉, 같은 시간에 검출기를 통과하는 두 개의 이벤트, ) 분석 후 데이터 수집. 이벤트의 설정 번호는 100000로 수집합니다. 보상 컨트롤 획득(해당되는 경우). </li><li> 데이터 수집 : 데이터 수집하기 전에 샘플을 텍싱 마십시오. 대신에 부드럽게 튜브를 활용하여 혼합한다. 처음 게이팅하는 동안, 낮은 압력에서 이벤트를 수집. 전체 인구에 문입니다. 이에 따라 히스토그램의 전압을 조정 일반적으로 흠없는 샘플의 피크는 두 번째 10 년 (10 두)에 해당됩니다. 게이트가 확립되고, 샘플이 처리되고 나면, 높은 압력으로 전환 할 수있다. </li><li> 분석 : FSC-W FSC 대 플롯에 의해 이중선을 시각화. 단봉과 이중선을 확인합니다. 단봉에 문입니다. 미토콘드리아 선택적 염료 긍정적으로 염색 이벤트에 게이팅에 의해 미토콘드리아 인구를 선택합니다. </li><li> 이소 타입 컨트롤에서 배경 표시를 확인합니다. 이소 제어 샘플을 사용 Mfn2 항체 양성 미토콘드리아 인구 라벨의 비율을 결정합니다. </li></ol>

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이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 ...

미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다. 현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석​​은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation. 이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량화를 허용 훨씬 덜 노동 집약적이고, 단일 샘플에서 미토콘드리아의 수천의 분석을 허용한다. 이 분석은 미토콘드리아에서 항시 존재하는 것으로 생각되는 미토콘드리아 외막 단백질의 거동 및 상대적인 양을 모니터에 적용 할 수있는, 미토콘드리아 표면 단백질의 채용, 또는 병리학 적 조건의 미토콘드리아에 mislocalized 단백질의 검출. 또한, 종래의 형광 인디케이터 염료의 혼입은 별개의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능의 특정 측면의 동시 평가를 가능하게소집단.

<table><tbody><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kontes Glass Co.&amp;nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparent, thin walled&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor and buckets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, density gradient medium</td></tr><tr><td>Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Must be fatty acid free for mitochondria</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&amp;nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>For sample acquisition by flow cytometry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &amp;micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Software used for analysis</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.

래트 척수 유래의 미토콘드리아는 Mitofusin2 (Mfn2), (8)의 미토콘드리아 외막의 융합에 관여 단백질에 표적 항체 immunolabeled 수있다. Mfn2 특정 항체와 형광 접합 된 이차 항체 분리 및 라벨에 따라, 미토콘드리아는 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 처리된다. 데이터 수집 후, 샘플은 제 도트 플롯 (도 2A)에 수집 된 모든 이벤트를 가시화하여 분석 소프트웨어를 이용하?...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K 조회수.  Université de Montréal, CRCHUM.  여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다. 

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Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

연구

생화학

미토콘드리아 접촉 부위의 분리

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 접촉 부위 및 아키텍처 인사이트 공개 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

면역학 및 감염병학

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

의학

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

생물학

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes, and mitochondrial DNA (mtDNA) copy number often feature in these processes. Human brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) recapitulate the brain&#39;s three-dimensional (3D) cytoarchitectural arrangement and offer the possibility to study disease mechanisms and screen new therapeutics in a complex human system. Here, we report a unique flow cytometry-based approach to measure multiple mitochondrial parameters in iPSC-derived cortical organoids. This report details a protocol for generating cortical brain organoids from iPSCs, single-cell dissociation of generated organoids, fixation, staining, and subsequent flow cytometric analysis to assess multiple mitochondrial parameters. Double staining with antibodies against the MRC complex subunit NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) or mitochondrial transcription factor A (TFAM) together with voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC 1) permits assessment of the amount of these proteins per mitochondrion. Since the quantity of TFAM corresponds to the amount of mtDNA, it provides an indirect estimation of the number of mtDNA copies per mitochondrial content. This entire procedure can be completed within a span of 2-3 h. Crucially, it allows for the concurrent quantification of multiple mitochondrial parameters, including both total and specific levels relative to the mitochondrial mass.

This protocol reports a unique method of using a streaming cytometer and multiple antibodies for simultaneous assessment of multiple mitochondrial functional parameters, including changes in mitochondrial volume, amounts of the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex subunits, and mitochondrial DNA (mtDNA) replication.

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, ...

신경과학

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

요약

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절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화