Name: fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues
Uploaded: 2014-02-24T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
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Ghanim 실험실에서 연구는 더 연구 보조금에 의해 지원되지 않았다. 독일 - 이스라엘 재단 (GIF)에서 908-42.12/2006는, 아니 부여합니다. IS-4062-07 미국 - 이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금 (BARD), 연구 보조금 아니요. MG 이스라엘 과학 재단 (ISF)에서 884 / 07

1. FISH 분석을위한 일반 가루이, 식물, 그리고 바이러스의 준비 <ol><li> 후면 B와 Q 생물 형면 모종 (고십 피움 히르 수툼 L. 이력서. 동명왕)에 가루이 및 25 ± 2 ° C, 상대 습도 60 %의 표준 조건 하에서 곤충 방지 케이지와 성장 객실 내부에 유지하고, 14 시간 조명 / 10 시간 어두운 광주. </li><li> 앞에서 설명한 15-19로 endosymbiont 특정 프라이머를 이용하여 endosymbionts 감염을 테스트하기 위해 PCR을 수행합니다. </li><li> 상업 보육 또는 식물 토마토 씨앗에서 토마토 모종 (까 esculentum 이력서. 비프 스테이크)를 구입. </li><li> 식물이 TYLCV 15 가루이 매개 접종에 가장 적합한 연령 (섹션 아래 4.1 참조), 네 사실 잎의 단계에 도달 할 때까지 상기 한 바와 같은 사육 조건에서 유지한다. </li></ol> 2. 엔도 해충 처리, 고정, 프로브 디자인, 하이브리드 및 시각화공생 물고기 <ol><li> 면 공장에서 흡입 10 성인 가루이를 수집, 또는면 잎에서 10 제 3 또는 제 4 령 약충을 선택합니다. </li><li> 즉시 에펜 도르프 튜브 내부 Carnoy의 정착 (클로로포름 에탄올 빙초산 6:3:1 권 / 권)에 몰두. (바람직 야간) 야간 2 시간 동안 수정. </li><li> 완전히 정착을 제거하고 2 시간 동안 에탄올에 6 %의 H 2 O 2의 탈색. </li><li> 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 샘플을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다. </li><li> 디자인 프로브 각 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자를 기반으로 보완 역 DNA 프라이머. 프로브를 설계 할 경우, 계정에 PCR 프라이머를 설계 같은 고려 사항을. 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용 BTP1 5&#39;-Cy5에-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, 5&#39;-Cy3가 사포닌 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-Cy3가 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;및 5&#39;-Cy3가 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;를 각각 Portiera, 리케차, Hamilonella 및 Arsenophonus, 특정 타겟팅. </li><li> ML 당 하이브리드 버퍼에 어둠 속에서 하룻밤 샘플을 교배 (20 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 0.9 M의 NaCl, 0.01 % [중량 / 부피 나트륨 도데 실 황산, 30 % [권 / 권] 포름 아미드) 10 pmol의를 포함하는 형광 프로브 . 필요한 경우 다른 형광 염료로 하나 이상의 프로브를 결합합니다. 대상 세균없이 프로브 샘플 부정적인 컨트롤과 비감염 가루이를 사용합니다. </li><li> 액체 차단제와 함께 포함 된 하이브리드 버퍼에, 현미경 슬라이드에, 전체 샘플을 장착 커버 슬립 커버, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 밀봉. </li></ol> 3. 가루이 기관 해부, 고정, 하이브리드 및 TYLCV 물고기에 대한 시각화 <ol><li> 지속적으로 흡입과 고대 근동에서 TYLCV에 감염된 토마토 식물에 사육 성인 가루이 수집아세톤 함침 종이 타월에 노출 sthetize. 아세톤에 너무 오래 노출 가루이 조직을 고칠 수있는 것 1 ~ 2 분 동안 가루이 노출. 특정 하이브리드를 확인하는 비감염 토마토 식물 및 컨트롤 대한 조사 샘플에 사육 nonviruliferous 가루이를 사용합니다. </li><li> 우울증 현미경에 장착 가루이 스테레오 현미경을 사용하여 장기의 해부에 대한 슬라이드. </li><li> 앞가슴에서 곤충의 머리를 당깁니다 및 1X PBS의 침샘을 해부는 그들의 작은 크기, 더 나은 시각화를 위해 1 % 톨루이딘 블루 염색으로 보충. 2 ~ 3 분 동안 얼룩의 흡수를 허용합니다. </li><li> 흉부와 관찰하고 중장을 추방하기 위해 복부 사이의 시점에서 떨어져 곤충을 잡아 당깁니다. 복부 끝에 집게로 눌러 복부의 내용을 추방. </li><li> 조심스럽게 성공 해부에서 PBS와 톨루이딘 블루를 제거하고 부드럽게 5 분 동안 장기를 해결하기 위해 Carnoy의 정착의 300 μl를 추가합니다. </li><li>해부 기관의 제어되지 않은 이동을 방지하기 위하여 오목 웰의 일측으로부터 아니라 위에서 정착액 인 dd. 일단 정착을 터치, 기관은 유리에 부착하고, 그 과정을 통해 그들은 이동하지 않습니다. </li><li> 정착액을 제거하고 TYLCV 외피 단백질 유전자의 서열에 상보적인 형광 DNA 프로브 Cy5에-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, 10 pmol의 보충 하이브리드 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 바닥에 젖은 수건 종이로 작은 플라스틱 상자로 구성된 작은 습기 챔버 내부의 표본으로 슬라이드를 배양하여 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 하이브리드. </li><li> 하이브리드에 이어, 미세 해부 도구를 사용하여 기관을 선택하고 신속하게 DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단제와 함께 포함 된 새로운 하이브리드 화 버퍼 30 μl를 포함하는 신선한 현미경 슬라이드로 이동합니다. </li><li> 커버 슬립과 표본을 커버, 재치를 밀봉형광 또는 공 초점 현미경 H 매니큐어와보기. </li></ol> 4. 공장 처리, TYLCV의 물고기를 손으로 절편, 고정 및 하이브리드 <ol><li> viruliferous 가루이 매개 접종을 사용 TYLCV와 토마토 묘를 접종한다. 바이러스 symptomless 식물이 FISH 방법 접종 후 1 주간을 이용하여 검출 할 수있다. 일반적인 질병의 증상은 눈에 보이는 3 주 후 접종입니다. 특정 하이브리드를 확인하기 위해 컨트롤에 감염되지 토마토 식물없이 프로브의 샘플을 사용합니다. </li><li> 토마토의 손으로 잘라 2-4센티미터 긴 길이 또는 단면을 제조하는 날카로운 조직 학적 면도날을 사용하여 줄기와 잎. </li><li> 에펜 도르프 튜브에서 2 시간에 실온에서 밤새에 Carnoy의 정착의 섹션을 수정합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 섹션을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다. </li><li> 섹션을 씻으하이브리드 버퍼에 세 번, 1 분마다. </li><li> TYLCV 코트 단백질 유전자의 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 형광 프로브를 Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;10 pmol의 보충 된 혼성화 완충액 500 μL와 섹션 혼성화. </li><li> 하이브리드 버퍼에, 절에 세 번, 1 분마다 씻으십시오. </li><li> DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단기에 포함 된 하이브리드 버퍼의 전체 마운트 섹션은, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 인감, 커버 슬립 커버. </li></ol>

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그 공장 주인과 곤충 벡터 식물 바이러스의 현지화 및 특정 가루이 호스트에 endosymbiotic 박테리아 여기에 설명 된 프로토콜은, 식물, 심지어는 동물 조직에서 다른 바이러스의 현지화에 적용 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 endosymbiotic 병원성 박테리아와 식물과 동물의 시스템에서 다른 미생물을 지역화하는 데 사용할 수 있습니다. 기술 된 방법은 짧은, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로?...

감염된 식물들은 호스트와 식물 바이러스 및 기타 병원체 간의 상호 작용을 연구 할 때, 그것은 그들이 호스트에 부정적인 영향을 야기하는지 여부를 불문하고, 동일 반응계에서 병원균 및 각각 핵산을 시각화하는 것이 중요하다. 식물 세포 내와 사이에 병원균의 움직임을 연구 할 때이 가장 중요하다. 병원체의 유전자 제품의 현장 현지화에서 병원성 과정을 연구하기위한 다른 방법을 보완하는 필수적인 단계이다. 많은 식물 병원체, 특히 바이러스는 자신의 벡터를 복잡하고 친밀한 상호 작용을 갖는 곤충에 의해 전달된다. 자신의 그림에있는이 바이러스의 현지화 전송 경로를 연구하는데 중요하고, 벡터 내부의 가능한 상호 작용 사이트. 일부 곤충 벡터가 식물 바이러스의 전송은 이들 곤충에 상주 endosymbiotic 박테리아에 의해 도움을 받는다. 더 나은 이러한 식물 바이러스 B의 전송을 연구하는자신의 벡터, 그것은 일반적으로 endosymbiotic 박테리아를 시각화, 특히 바이러스의 전송에 관련된 사람들, 또한 필수적입니다 Y. 바이러스와 endosymbiotic 박테리아의 colocalization을 따라서 자신의 곤충 호스트 이내에 생물 사이의 가능한 관계를 조사를 위해 요구된다. 이외에도 바이러스 전송에서, endosymbiotic 박테리아가 곤충 벡터의 생물학의 여러 측면에 영향을 미치는, 곤충 이내에 세균 따라서 공간 현지화 높은 관심과 중요하다. 토마토 노란 잎 말림 바이러스 (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae)는 전 세계적으로 1-4 재배 토마토의 가장 중요한 바이러스 성 질병의 복잡합니다. TYLCV는 사부 제한 바이러스 독점적 가루이 담배가 담배가 루이 5,6에 의해 벡터가된다. 자신의 가루이 벡터의 begomoviruses의 전위를 설명하는 모델은 6-9 제안되었다. 두 가지 특정 장벽을 적극적으로 DUR 교차중장 / 체액과 체액 / 침샘 장벽이이 순환 전송을 보내고. 이 송신 처리는 바이러스 캡시드를 인식 불명 수용체에 의해 매개되는 것으로 가정된다. TYLCV는 B를 교차 생각된다 이 식물에 주입되기 전에 담배가 루이의 중장 6,10, 그리고는 기본 침샘 (6)을 통해 흡수된다. 가루이 체액에서 TYLCV는 곤충 보조 endosymbiotic 박테리아 Hamiltonella에 의해 생산의 GroEL 단백질과 상호 작용합니다.이 상호 작용은 체액에서 TYLCV의 안전한 전송을 보장하고, 곤충의 면역 체계 11. Hamiltonella 및 Portiera, 기본 endosymbiont의 공격으로부터 보호 가루이의, bacteriocytes에 보관되어, 체액 및 집 endosymbiotic 박테리아 11. B.에서 발견 된 곤충 세포 담배가 루이는 리케차, Arsenophonus, Wolbachia 및 프리쉬 등의 추가 endosymbiotic 박테리아를 항구bacteriocytes 내부 또는 외부에 현지화 할 수 있으며, EA는, 곤충의 생물학 (12)에 다양한 영향을 미친다. 여러 보고서가 미세한 두께 섹션 10, 13에 현장에서 이러한 투과 전자 현미경 (TEM), 항체 및 RNA 등 많은 시간과 비용이 많이 드는 프로토콜을 사용하여 식물과 가루이의 TYLCV의 현지화를 연구하려고했습니다, 최근의 연구는 지역화를 설명 간단한 프로토콜 14을 사용하여 자신의 공장 및 벡터 호스트 내부의 식물 바이러스의. 여기에서 우리는 B에서 TYLCV의 지역화를위한 간단한 프로토콜을 설명 담배가 루이가 인 midguts과 침샘을 해부하고, 절에서 TYLCV에 감염된 식물에서 준비했습니다. 우리는 더 Portiera, B의 기본 endosymbiont의 현지화를 설명 담배가 루이, 그 차 endosymbionts Hamitonella, 리케차 및 Arsenophonus은.이 프로토콜은 짧은 DNA 프로브를 사용을 기반으로하는찬란하게 자신의 5 &#39;말단에 표시하고, 특히 바이러스 성 또는 세균성 유전자 서열에 상보적인 서열에 하이브리드된다. 샘플 처리는 비교적 쉽게 얻어진 신호는 매우 다릅니다. 기술 된 프로토콜은 식물, 동물 및 곤충 호스트에서 바이러스, 세균 및 기타 병원체를 집중하는 데 사용될 수 있고, 추가로 임의의 주어진 조직에서 mRNA를 지역화하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Fluorescently labeled&amp;nbsp; Probes</td><td>Metabion</td><td>20 bp HPLC purified</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 일반적으로 진핵 세포의 유전자 사본을 시각화하고 추가 바이러스 나 세균 감염과 같은 세포의 다른 구성 요소를 시각화하기 위해 수정 될 수 있습니다에 사용되는 다양한 기술에 주어진 이름입니다. 공간 현지화 및 감염 과정에서 바이러스와 박테리아의 시각화는 다른 자극에 대한 응답으로 이러한 마이크로 어레이 및 RNAseq로 표현 프로파일 링 실험을 보완하는 필수 단계입니다. 이러한 에이전트와 시공간 감염을 이해하는 세포 구성 요소와의 상호 작용을 이해하기위한 생물학적 실험을 보완합니다. 이러한 리포터 유전자 시스템이나 면역 조직 화학적 방법으로 바이러스와 박테리아를 시각화하는 몇 가지 기술은 시간이 많이 소요되어, 일부는 모델 생물로 작업하고 복잡한 방법을 포함하도록 제한됩니다. 세포 내에서 RNA 또는 DNA 종을 대상으로 FISH는 상대적으로 쉽고 빠른 날입니다유전자의 시공간 현지화을 연구 및 진단 목적으로 THOD. 이 방법은 강력하고 프로토콜이 비싸지 않다 짧은 혼성화, 시중에서 구입 한 프로브를 사용하면 비교적 쉽게 구현할 수 있습니다. 샘플 준비, 고정, 하이브리드, 현미경 시각화 복잡한 단계를 포함하지 않는 경우에 특히 강력합니다. 여기에서 우리는 곤충과 식물 조직에서 박테리아와 바이러스의 현지화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 자신의 5 &#39;또는 3&#39;에 형광 염료에 접합 된 짧은 DNA 프로브가 종료 20 염기쌍 간단한 준비, 고정, 곤충 전체 마운트 및 해부 기관 또는 손으로 만든 플랜트 섹션의 하이브리드 화에 기반하고있다. 이 프로토콜은 성공적 곤충 및 식물 조직의 개수에인가되었으며, 셀에서의 mRNA 또는 기타 RNA 또는 DNA 종의 발현을 분석하기 위해 사용될 수있다.

이 원고에서 공부 시스템은 그림 1과 TYLCV와 감염된 식물, 성인 및 가루이 B의 요정이 포함되어 있습니다 담배가 루이, 그리고 곤충에 TYLCV 전좌의 경로를 보여주는 가루이의 내부 해부학. 2 차 공생 Portiera와 보조 공생을위한 성인 가루이에 두 번 생선을 보여줍니다 Arsenophonus. 그림 3은 Portiera 및 Hamiltonella에 ...

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Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

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Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

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23.4K 조회수.  Volcani Center.  우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다. 

비디오: Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

신경과학

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

생물학

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

<meta charset="utf8"></head><body>OPTIR-FISH를 사용한 세포 식별 및 대사 분석을 위한 포괄적인 프로토콜

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 복잡한 환경에서 단일 세포 대사 및 정체성 분석을 위한 통합 OPTIR-FISH

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

생체공학

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

형광

요약

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형광성의

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.