우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 저희는 효모 균주 MHY3765에 대한 마크 Hochstrasser 감사합니다. 이 작품은 NSF 교부금 1,051,970 (OK)로와 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 여행 그랜트 먼로 학자 프로그램 그랜트 (ES를)에 의해 지원되었다.

기본 조건에서 발아 효모 세포에서 발현 6xHIS - 태그 단백질의 정제 1. 단백질 발현의 효모 세포와 유도의 성장 (2에서 수정) 선택 사항 : 관심 대신 아래에 설명 된 갈락토스에 의한 문화의 단백질을 표현 대수 성장 효모 배양을 사용합니다. <ol><li> 플라스미드 인코딩 갈락토오스 유도 선택의 단백질 6xHIS - 태그와 함께 걸 + 효모 균주의 세포를 변환 할 수 있습니다. 예를 들어, 시약 목록을 참조하십시오. </li><li> 2 % 자당을 포함하는 적절한 선택 배지 5 ㎖ (예 : SD-우라실)에 형질 전환을 접종. 30 ° CO / N, 회전을 품다. </li><li> 600 nm에서 광학 밀도가 2 % 자당과 선택 배지 33 ㎖에 0.3 (= 0.3 OD 600)를 측정하므로 O / N 문화를 희석. (Δ150 RPM) 흔들어, 30 ° C에서 성장. </li><li> 문화 OD 600 = 0.8에 도달했을 때-1.5, 2 % 갈 락토 가진 1x YEP의 최종 농도 6 %의 갈락토스 (표 1 레시피)과 배 YEP의 17 ML을 추가하여 원하는 단백질의 발현을 유도. 전체 문화 볼륨 지금은 50 ML이다. 부화, 추가로 5-6 시간 동안 30 ° C에서 떨고. 참고 : 문화 볼륨이 변경 될 수 있습니다. 원하는 최종 볼륨의 3 분의 2로 단계 1.3, 희석을합니다. 단계 1.4에서 배 YEP / 6 % 갈락토스의 3 분의 1의 최종 볼륨을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 5 분 동안 유도 문화와 원심 분리기 세포의 Δ150-200 OD 600 단위의 OD 600을 측정 </li><li> 1X 프로테아제 억제제 칵테일 2 ML 나사 캡 튜브로 전송과 1 ML 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 1 분간 세포를 원심 분리기 ° C. 가만히 따르다 뜨는을. </li><li> -80에서 즉시 세포 용해 또는 저장 ° C 더 사용할 때까지 다음, 액체 질소에 동결 세포 펠렛을 끼 웁니다. </li></ol><ol><li> 이전 단계에서 냉동 세포 펠렛으로, 산 세척 유리 구슬 200 μL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 μl를 (표 1, 선택의 세포 용해 버퍼를 사용 제조법)을 추가합니다. </li><li> 간단히 피펫 아래. 그것은 완전히 세포 펠렛을 resuspend을 할 필요가 없습니다. 항상 얼음에 튜브를 유지한다. 참고 : 피펫 팁의 끝 부분과 위아래로 pipetting 전에 잘릴 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에, 장소 비드 밀, 균형, 잠금, 별, 제조업체의 지침에 따라 컴퓨터를 실행에 세포 튜브 (들). </li><li> 5.5에서 20 초 동안 튜브 (들)을 포함하는 비드 비터 미터 / 초, 후 1 분 동안 녹은 얼음에 배치를 실행합니다. 총 배 반복합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 15 분간 원심 분리하여 추출 된 단백질을 취소 ° C. 선택 사항 : SpinX 필터를 통해 원심 분리하여 작은 입자를 제거합니다. </li><li> 전체 세포 전자의 샘플을 준비서양 얼룩에 의해 관심의 단백질의 존재를 확인하기 위해 (WCE) xtract : <ol><li> 800 ㎕의 20 % 삼염화 초산 (TCA)에 대한 세포의 2 OD 600 단위 (삭제 추출물 등 5 μL 세포의 200 OD 600 단위를 수확 한 경우)와 해당 WCE 추가 할 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이. </li><li> 4 ℃에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 한 다음 펠렛와 소용돌이 튜브 TCA 2 %의 800 μL, ° C. 추가 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> TCA 샘플 버퍼 100 μL (표 1 레시피), 펠릿을 용해하는 소용돌이를 추가합니다. 참고 : 샘플 버퍼 펠렛에 추가 한 후 (노란색으로 변) 산성되면, Δ10 μL 트리스베이스의 분주 추가 [1M] 샘플이 다시 파란색까지. </li><li> 2-5 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어. </li><li> 소용돌이 AG펠렛의 잔해가 여전히 존재하는 경우 아인 완전히 용해합니다. 이 방법에 의해 제조 펠렛 완전히 용해 악명 어렵습니다. 완전히 알약을 용해 소용돌이로의 Δ10 분 걸릴 수 있습니다. </li><li> -80에서 보관 샘플 ° C 더 사용할 때까지. </li></ol></li><li> 더 이상 사용할 때까지 -80에서 액체 질소와 저장소에 남아있는 삭제 WCE ° C의 분주 동결 웁니다. </li></ol> 3. 효모 세포 균질 액에서 단백질의 일괄 정화 참고 :이 정화 방법은 CO 2 + 금속 친 화성 수지에 6xHIS - 태그 단백질의 정제에 최적화되었다. <ol><li> 수지 평형 <ol><li> 세포의 Δ20-40 OD 600 단위에서 준비 삭제 WCE의 샘플은 microcentrifuge 관에 친 화성 수지의 50-100 μl를 추가합니다. , 원하는 단백질 또는 아밀로오스와 같은 비특이적 수지를 표현하지 않은 세포에서 추출한 단백질은 대조군으로 사용할 수 있습니다특이 바인딩의. </li><li> 세척 버퍼 1 ML과 배 수지를 세척 : 상단에 바닥 반전 수지는 현탁 한 후 4시에 5,000 rpm에서 1 분간 회전 될 때까지 ° C. 뜨는을 대기음. 참고 : 같은 날에 추출 및 정제를 수행하는 경우, 수지 평형을 추출하기 전에 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 친화력 정화를위한 단백질 바인딩 <ol><li> 50-100 μL 세척 구슬로 클리어 해물 100-200 μl를 (Δ20-40 OD 600 단위)를 추가하고 용해 버퍼 1 ML에 총 볼륨을 가져옵니다. </li><li> 2-5 시간 동안 4에서 장동 또는 흔들 ° C로 품어. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 1 분간 회전 </li><li> 원하는 경우, 언 바운드 단백질의 후속 분석을 위해 남은 상층 액의 샘플을 저장합니다. TCA는 WCE (단계 2.6)에 대한 상기 설명 된대로 침전. </li><li> 5,000 rpm에서 1 분 동안 회전 한 다음 세척 버퍼 1 ML과 함께 배에 바인딩 단백질과 수지를 씻어4 ° C. 세척하는 동안 샘플 차가운 유지하십시오. </li></ol></li><li> 바인딩 단백질의 용출 <ol><li> 4에서 수지 nutate을 150 μL 용출 버퍼를 추가 ° 5 분 C, 4 5,000 rpm에서 1 분간 회전 ° C와 새로운 튜브에 뜨는을 저장합니다. 옵션 : 2X와 풀 elutions를 반복합니다. </li><li> 서양 얼룩에 대한 용출 샘플을 준비 용출 된 단백질의 25 μL에와 25 μL 2X 리튬 도데 실 황산 (LDS) 샘플 버퍼를 추가 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 (BME) 2 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어.에게 참고 : 표준 2X Laemmli에 샘플 버퍼를 사용할 수도 있습니다. </li><li> 액체 질소에 동결 초과 용출 단백질을 끼 웁니다. 선택 사항 : 65 배 LDS 샘플 버퍼의 동일한 볼륨 수지 스트립 나머지 단백질 ° C 5 분, 새로운 튜브에 LDS-용출 단백질을 제거한 다음이 아닌 수지, 용출 된 단백질에 2 μL BME를 추가합니다. 이 순서는 conjuga 어떤 이온 항체의 제거를 방지하는 것입니다비즈 테드. </li><li> -80 ° C 더 사용할 때까지 매장 샘플. </li></ol></li><li> 적절한 항체와 서양 얼룩 및 프로브 단백질을 시각화합니다. <ol><li> 각 샘플의 20 μl를 (Δ1-3 OD 600 대)과 선택의 SDS-PAGE 젤의 단백질 사다리의 3-10 μl를로드합니다. 정기적으로이 프로토콜에 사용되는 젤 4-12% 비스 - 트리스 8 % 트리스 - 글리신 있습니다. </li><li> 50 분 동안 200 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 (표 1의 조리법)를위한 19 V에서 세미 드라이 송금 젤에서 PVDF 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> 4 % milk/1x 트리스 블록 막 4 ° C (표 1 레시피)에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 식염수 TWEEN (TBST)를 버퍼. </li><li> 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 1-3 시간 동안 4 % milk/1x의 TBST에 대한 관심의 항원 - 태그 단백질 일차 항체로 막을 배양 </li><li> 5 분 1X TBST로 각각 3 배 막 씻으십시오. </li><li> 적절한로 막을 배양보조 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 복합 RT에서 1-3 시간 동안 항체. </li><li> 1X TBST의 큰 볼륨 15 분 각 배 막 씻으십시오. </li><li> 사란 랩 ECL 기판과 랩으로 막 커버. </li><li> 필름 막 노출하고 단백질을 시각화하기 위해 개발. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 그대로, 네이티브의 준비에 초점을 맞추고, 사후 translationally 다운 스트림 응용 프로그램의 신진 효모 세포에서 단백질을 수정했습니다. 이 프로토콜을 시도하기 전에, 그것은 관심의 단백질이 쉽게 상태에게 12 변성에서 준비 단백질 추출물에서 발견 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 클론 항체를 사용할 수없는 경우는 융합 단백질은 서양 말에서 감지 할 수 있도록...

효모 유전학의 최고 힘은 전설이지만, 신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의,에서 네이티브 단백질의 준비 및 분석은 종종 문제가 고민입니다. 후자는 상당한 기계적 강도와 효모 세포벽 1의 탄력성 때문이다. 다른 방법은 효소, 화학, 기계, 압력 기반의 전체 세포 단백질 추출물 2-6를 얻기 위해 효모 세포의 파괴에 대해 설명하고있다. 이 기술은 이후의 분석이나 정제 단계에 사용할 수있는 휴대 대표 네이티브 단백질 추출물을 산출하기 위해 효능 널리 다릅니다. 예를 들어, 효모 세포벽은 세포 용해 효소 (예 : zymolyase) 및 결과 spheroblasts으로 제거 할 수는 전단, 세제, 또는 단백질을 해제 삼투 용해에 의해 중단 될 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 많은 세포 내 fractionations의 시작 지점으로 고용하지만 긴에서 incubate을 필요로하고있다일부 단백질 7의 안정성과 호환되지 않습니다. 효모 세포의 단백질의 화학적 추출을위한 독자적인 효모 용해 시약 (예 : 세제)를 상업적으로 사용할 수 있지만이 단백질 추출 시약 및 단백질의 후속 생화학 적 특성에 미치는 영향의 효과는 항상 8 명확하지 않습니다. 자주 프랑스어 프레스로 불리는 고압 균질는 효과적으로 최초의 고압에게 복종하고 압력 셀에있는 작은 구멍을 통해 그들을 압출하여 효모 세포를 휴식. 이 기술은 높은 품질의 추출물을 생산하지만, 장비는 매우 고가이며, 세포 또는 여러 샘플 9 소량 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비드 밀 효모 세포의 기계적 장애는 종종 기본 효모 단백질 제제 10에 대한 선택의 방법입니다. 이 기술은 산 워싱턴 주와 효모 세포 벽의 기계적 장애를 포함셰이커, vortexers 또는 비드 공장의 다양한 수행 할 수 유리 구슬을 흘렸다. 특히이 방법은 동시에 여러 작은 샘플 (세포 이하 1 ㎖)을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 구슬 또는 구슬 밀 중단 매트릭스는 이제 2 ㎖ 튜브에 세포 유형의 거의 모든 종류를 방해하는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 다른 기술과 장비를 고려, 비드 밀 단백 분해 효소 및 / 또는 프로 테아 억제제의 적절한 버퍼를 활용하고, 특히 효모 세포의 파괴와 같은 sumoylation로 번역 후 수정 사항을 보존하는 데 도움이 매우 빠르게 발생하는 추가 이점이 있습니다 및 추출물의 온도 제어됩니다. 이 프로토콜은 단백질 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하는 궁극적 인 목표와 부드러운 상태에서 내생 이상 발현 단백질의 빠르고 효과적이며 신뢰할 수있는 추출에 초점을 맞추고 있습니다. 성장 매체, 세포 용해 버퍼조성 및 비드 밀 설정은 단백질 상호 작용과 같은 sumoylation와 ubiquitylation로 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast ORF strain in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vector</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td></tr><tr><td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &amp;micro;m (30-40 US sieve)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Use for additional filtering of clarified lysate</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Protein gel stain</td></tr><tr><td>Mammalian Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternative commercial lysis buffer</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Method of immunoprecipitation</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anti-myc antibody</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

구슬을 쳐서 균질화 방해 악명 어려운 신진 효모 세포에서 DNA, RNA, 단백질 및 대사 산물을 해제하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 여기에서 우리는 기능, 상호 작용과 단백질의 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화 된 버퍼로 단백질의 추출을위한 비드 밀 균질의 사용을 설명합니다. 관심의 단백질을 발현 대수 성장 세포 선택 액상 성장 미디어에서 재배된다. 성장 매체를 유도 프로모터 (예 : 갈락토스)에서 단백질 발현을 유도하는 약으로 보충 할 수 있습니다 (예 : nocodazole) 세포주기 단계를 동기화하거나 (예 : MG132) 프로 테아 기능을 억제. 세포는 침전 및 분해 효소 및 / 또는 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 적절한 버퍼에 재현 탁하고도 즉시 처리 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 냉동. 균질화은 20 초 BEA의 여섯 사이클에 의해 수행됩니다D-구타 (5.5 m / 초), 얼음의 한 분 배양 한 다음 각. 결과 균질는 원심 분리에 의해 제거되고 작은 입자는 여과에 의해 제거 할 수 있습니다. 결과 삭제 전체 세포 추출물 (WCE)은 웨스턴 블롯 다음 SDS-PAGE로 전체 단백질의 직접적인 분석을 위해 TCA 20 %를 사용하여 침전된다. 추출물은 특정 단백질의 친화력 정화, 번역 후 수정 또는 공동 정화 단백질의 분석의 검출에 적합하다. 대부분의 단백질 정화 프로토콜의 경우와 같은 일부 효소와 단백질은 정제 및 다른 사람을위한 유일한 조건이나 버퍼 조성물에 명시된 조건을 불안정하거나 용해 할 수 필요할 수 있습니다. 후자의 경우, 제시된 프로토콜은 경험적으로 단백질 추출 및 정제를위한 가장 비드를 제패 전략을 결정하는 데 유용한 출발점을 제공 할 수 있습니다. 우리는 에피토프 태그가 SUMO E3 리가, Siz1, 세포주기의 추출 및 정제를 보여Slx5, sumoylated 및 인산화뿐만 아니라, SUMO-대상 유비퀴틴 리가 소단위 모두되어 단백질을 규제.

우리의 대표적인 결과를 설명 비드 구타와 단백질 추출 프로토콜 스트림 응용 프로그램 (표 2에 요약)의 다양한 단백질의 재현성 준비에 유용 밝히지. WCEs의 쿠마시 염색 이어 SDS-PAGE 단백질 (~ 12&gt; 250 kDa의)의 넓은 범위 재현성 효모 세포 (그림 1A)에서 추출 할 수 있음을 보여줍니다. 분자량의 범위 이산 밴드는 양질의 단백질 추출물의 지표입니다. 추출물의 품질은 서양 ?...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

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24.8K 조회수.  The College of William & Mary.  높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다. 

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

연구

생화학

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

유전학

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

생물학

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

요약

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