본 연구는 혁신 분야에서 과학 연구 보조금에 의해 지원되었다 &quot;중시 Neurocircuitry&quot;(제 22115002) 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부의 &quot;포괄적 인 뇌 과학 네트워크&quot;(제 221S0003) 기술에 일본과 그랜트 - 원조 일본 학술 진흥회의 젊은 과학자 (B) (제 21700344) (JSPS)로 HK

1. 애벌레 준비 <ol><li> 표준 비행 음식을 포함하는 플라스틱 병에 UAS-ChR2 또는 OK6-GAL4, UAS - NpHR2, OK6-GAL4 라인 비행을 유지합니다. </li><li> 확산 효모 적절한 농도 (ChR2 1 밀리미터, 사과 주스 한천 플레이트에 NpHR2 (줄여서 &quot;NpHR&quot;)에 대한 10 MM에서 (ATR) 모든 트랜스 망막을 포함한 붙여 넣습니다. </li><li> 유리 병에서 2 차 또는 3 차 instar의 유충을 선택하고 ATR 함유 접시에 넣어. </li><li> 25 키우는 적절한 시간 동안 어둠 속에서 ° C (NpHR에 대한 ChR2 2 일 1 하루입니다.) </li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> C-마운트 부착 (배율 0.35x)와 기존의 공 초점 현미경 (우리의 경우, FV1000 올림푸스)에 CCD 카메라 (XCD-V60, 소니)를 연결합니다. </li><li> 대물 렌즈의 레이저 스캔 중에 닫 CCD 카메라에 빛의 경로를 따라 셔터가 있으면 조심스럽게 제거합니다. 이 단계는 마이크로에 달려필요한 경우 설치에 대응, 기술 지원 현미경 제조업체에 문의하십시오. </li></ol> 3. 해부 <ol><li> 몸에서 남아있는 음식을 제거하기 위해 물 ATR 자란 유충을 씻어. </li><li> 실 가드 코팅 접시, 등쪽까지 (지느러미 쪽, 등쪽 정중선의 양쪽을 세로 방향으로 실행하는 두 기관 튜브가)에 유충을 넣어. 실 가드의 두께는 5mm 정도이다. </li><li> 집게 (5 이녹스, 뒤몽 FST, 스위스)와 기관 튜브 사이의 꼬리에 곤충 핀 (리츠 곤충 핀, Φ0.10mm, 스테인리스)를 삽입합니다. 핀, 10mm 길이에 대해, 굽거나 대물 렌즈의 표면을 타격하고 손상을 방지하기 위해 (~ 2mm 길이)만큼 짧게 절단해야합니다. 그런 다음 입으로 훅, 앞쪽 끝에 검은 발톱 같은 구조 근처 유충의 머리에 두 번째 곤충 핀을 넣어. </li><li> 칼슘 2 + 무료 생리 식염수 (염화나트륨 140 mm의, KCl을 2 개 mm, MgCl 2 6 mm의 HEPES-NaOH를 5 mM의 추가유충은 촉촉한 유지하는 자당 36 MM (pH7.1)). </li><li> 마이크로 가위 (MB-50-7 Napox, 일본)와 꼬리 근처에 작은 절개를합니다. </li><li> 절개에서 머리로 등쪽 정중선을 따라 길이 방향 절단을합니다. 복부 신경 코드 (VNC) 및 축삭 손상되지 않도록주의해야합니다. </li><li> 옆 머리에 작은 절개를합니다. </li><li> 해부 bodywall의 각 모서리에 4 개의 핀을 놓습니다. 몸 벽은 신체 벽의 분절 패턴을 시각화 할 수있을만큼 뻗어 있지만, 연동 운동을 방해하지 너무 많이해야합니다. </li><li> 뇌와 VNC를 제외하고 내부 장기를 제거하고 + 무료 생리 식염수 칼슘과 샘플을 씻어. </li><li> 몸을 벽에 곤충 핀의 위치와 방향을 변경하여 양측 대칭으로 복부 신경 코드의 방향을 조정합니다. 복부 신경 코드의 위치를​​ 수정하려면, 실 가드 아래로 연결 뇌와 입 사이의 조직을 통해 핀을 삽입합니다. </li> &lt;리&gt; 2 mm 인 버퍼를 교체 칼슘 2 + 링거 용액 (NaCl을 130 MM의 KCl을 5MM, MgCl 2 2mm의 염화칼슘 2 MM의 HEPES-NaOH를 5 개 mm, 자당 36 MM (pH7.3)). </li></ol> 4. 레이저 조명과 영상 <ol><li> 공 초점 현미경 배 건조 대물 렌즈 (UPlanSApo 배, NA 0.16, 올림푸스, 일본) 연결하고 무대에 유충 준비를 설정합니다. </li><li> 공 초점 현미경 복부 신경 코드를 찾습니다 빨간 레이저 (633nm 인)를 해부 준비의 전송 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 스캔 각각 ChR2 또는 NpHR의 불필요한 자극을 유도하는 488nm 또는 559nm 레이저를 사용하지 않도록합니다. </li><li> 전송 된 이미지에 대한이자 (ROI)의 영역을 정의합니다. 확대 모드는 ROI의 자세한 결정에 유용 할 수 있습니다. </li><li> 488nm 또는 559nm 빛으로 조명하는 현미경의 필터 설정을 변경합니다. </li><li> 몸을 벽을 시각화 할로겐 램프의 준비를 조명. 목전자 준비는 공 촛점 현미경에 부착 된 CCD 카메라로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 몸을 벽의 움직임을 기록하고 움직임을 모니터링 상태에서 레이저 빔을 전환 끄십​​시오. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신경 활동의 시간적, 지역 섭동은 신경 회로의 네트워크 역학 분석을위한 귀중한 기술이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 레이저를 이용하여 optogenetics하여 신경 활동을 조작하는 방법을 제시한다. 레이저의 높은 방향성 수은 또는 크세논 램프를 사용하여 넓은 시야의 자극보다 더 지역화 optogenetic 자극 할 수 있습니다. 레이저 조명은 이미 이전의 연구에서 optogenetics에 적용되어 있지만, 같은 유리 섬유, micromanipulator에, 레이저 소스와 같은 특별한 설정은 대부분의 이전 연구에 필요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 지역의 조명에 종래의 공 촛점 현미경을 사용합니다. 공 촛점 현미경 시스템이 널리 사용되기 때문에,이 방법은 많은 실험실에서보다 높은 해상도 optogenetics을 적용 할 수있는 기회가 열립니다. 유충의 해부 및 레이저 힘 : 프로토콜은 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 뇌, 복부 신경 코드 또는 운동 신경 운영 시간에만 손상을 입히는 경우NG 해부, 유충이 덜 전시 또는 없음 자연스러운 연동 운동합니다. 정밀 스프링 가위 등의 측면에 절개를 만들고 집게와 내부 장기를 제거 할 때 특히 필수적이다. 해부에 대한 자세한 정보는 이전에 21보고되었습니다. 둘째, 만약 충분한 자극에 대한 0.1의 레이저 파워 ~ ChR2 또는 1 NpHR을위한 ~ 10 mW의 / mm 2가 필요합니다 1 mW의 / mm 2 달성 할 수있다. 우리는 조명의 예상 면적으로 나눈 대물 렌즈 아래에 총 빛의 힘으로 레이저 파워를 평가했다. 우리는 파워 미터 (mobiken, 산와 MI 테크노스, 일본)를 사용하여 전체 광 전력을 측정했다. 우리는 원형 일정한 시간 약 회절 한계에 조명 영역을 제공하는 레이저의 파장의 제곱 조명의 영역을 추정 하였다. 샘플에 효과적인 조명 전력은 스캔 속도와 감각을 변경하여도 레이저 출력의 힘에 의해뿐만 아니라 조정 할 수 있지만,반복 어. 우리는 63 시간을위한 20 ~ 100 마이크로 초 / 픽셀로 레이저를 검색합니다. 또한, optogenetics 단백질과 ATR의 양의 발현 수준은 자극 효율성을 위해 중요하다. 레이저 파워 (현미경 시스템을 최적화하여), 2) optogenetics 단백질의 발현 수준 (유전자형과 양육 온도를 확인하여), 3) 금액은 1) : 유충이 더 optogenetic 반응을 보였다 없을 경우 따라서, 다음 사항을 점검하고 수정해야합니다 ATR (ATR의 농도를 조정하고 기간을 공급하여). NpHR 13 알 수없는 이유에 의하여 ChR2보다 ATR의 높은 농도를 필요로합니다. ChR2는 여기에 설명 된 것보다 낮은 ATR (예를 들어 0.1 MM) (1 ㎜)를 포함하는 음식을 사육 유충에서 잘 작동합니다. 1 ㎜의 ATR에 유충을 먹이는 ChR2 사진 반응을 만들기위한 충분로서, 우리는 ChR2 실험의 첫 번째 재판이 농도를 권장합니다. ATR의 농도는 이후 1 ㎜에서 아래로 적정 할 수 있습니다. ATR에 대한 노출 기간에 관해서는, 우리는 추천기간은 강력한 optogenetic 제어를 위해 여기에 설명. 우리는 종종 짧은 기간 동안 ATR에 유충을 먹이 때 optogenetic 반응을 관찰하는 데 실패했습니다. 이 프로토콜에서는, 레이저 조명 및 이미지 수집은 별도의 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 그래서, CCD 카메라로 레이저 조명의 시공간적 패턴의 명확한 탐지 데이터 분석을위한 중요합니다. 레이저 반점이나 줄이 CCD 이미지의 희미한 경우, 할로겐 램프 및 신체 벽에 볼을 유지하면서 레이저 조명을 시각화하는 CCD 카메라의 게인 값의 파워를 최적화합니다. 이 프로토콜에서와 같이 시공간 조명 애벌레 모터 회로에 대한 정보를 제공하지만, 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 에 관해서는 &quot;공간&quot;부분, 조명의 위치는 몸을 벽의 움직임을 비디오 테이프에 사용되는 낮은 배율 CCD 이미지가 기록됩니다. 따라서, 조명 영역은 세포 수준에서 세그먼트 레벨에서 할당하지만 할 수 있습니다. &quot;T에 관해서레이저로 공 초점 현미경 조명에 의해 레이저 스캔에 전환 사이 emporal &quot;측면, 시간 지연은 공 촛점 현미경 시스템 및 스캔 상태에 따라 달라집니다. 따라서, 시행 착오에 의해 약간의 테스트가 조명 시간을 조절해야합니다. 조명의 타이밍이 할 수 있기 때문에, ImageJ에 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 CCD 이미지 영화에서 결정, 시간적 해상도에서 중요한 요소는 CCD 카메라 영상의 프레임 속도입니다. 우리는 일반적으로 초당 7.5-15 프레임에 대한 프레임 속도를 설정합니다. optogenetic 도구의 발전은 우리에게이 프로토콜을 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 우리는 제 3 령기 OK6-GAL4을 가진 애벌레와 UAS-ChR2 [H134R] 또는 UAS-NpHR2를 사용했습니다. 대신 ChR2의 다른 optogenetic 도구 [H134R] 또는 NpHR2 같은 ChR2로 [T159C/E123T] NpHR3 또는 아치 활동 제어 (22)의 효율을 높일 수 있습니다. 또한, 다른 GAL4 라인을 사용하거나 다른 발달 단계에서 분석하면 모터 circui에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다TS. 이 프로토콜에서는, 모터 활동은 CCD 카메라로 bodywall 수축의 전송 이미지에 의해 측정 하였다. ChR2 또는 NpHR과 신경 활동을 조작하면서 칼슘에 민감한 형광 분자 (예를 들면 GCaMP)와 모터 뉴런의 활동을 직접 모니터 할 수 있습니다. 이 경우, 광범위한 지역과 고감도 CCD 카메라 (예 : EMCCD 카메라)의 푸른 빛 조명은 할로겐 램프 대신에 사용하고 일반 CCD 카메라는 이전에 여기에 설명되어 있습니다. 낮은 배율 렌즈 샘플 및 모니터링 bodywall 위의 높은 배율의 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)에 의해 복부 신경 코드의 조명 : 추가 대물 렌즈를 사용하여 모니터링 bodywall 운동은 더 진보 된 방법이 될 수 있지만 자극의 공간 분해능을 향상시키기 위해 (예 : 4 개) 샘플 아래에. 이 듀얼 렌즈 시스템은 우리가 높은 공간 해상도 신경계를 자극 할 수 있습니다.

초파리 유충에서 앞으로 연동 운동은 전방 세그먼트 후방에서 근육 수축의 전파에 의해 발생합니다. 이 운동은 세로 몸 축을 따라 복부 신경 코드 내에서 모터 뉴런의 연속 활성화에 의해 실현됩니다. 이 패턴 전파 활동 뒤에 회로를 검사하려면, 신경 활동 지역의 섭동은 정보 접근 방법이 될 수 있습니다. 약물 분석은 신경 조직에서 신경 전달 물질과 같은 특정 물질을 제어 할 수 있지만 유충의 복부 신경 코드가 세로 축을 따라 유사한 neuromeres로 구성된 반복적 인 구조이므로, 약물 약물의 효과는 거의 모든 세그먼트 사이에서 유사 할 수 있습니다. 또한, 하나의 세그먼트 소수 optogenetic 또는 온도에 민감한 프로브 분자를 표현할 수 있습니다. 그러나, 특정 GAL4 라인을 생성하기가 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 몇 가지 세그먼트에서 뉴런을 조작하기위한 방법을 제시레이저 조명을 사용하여 사항. 공 초점 현미경 공간적으로 국한 조명의 장점 복용 한 지역에서 뉴런의 활동을 교란 할 수 있습니다. 뉴런 특정 GAL4 라인의 하위 집합으로 프로브의 발현 패턴과 결합,이 레이저 조명 방식은 크게 교란에 대한 공간 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 기존의 공 초점 현미경을 필요로하기 때문에, 추가 실험실 장비의 구입은 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 모터 출력 13 전파하는 동안 모터 신경 세포 활동의 역할을 하였다. 연동 운동하는 동안 몇 가지 부분에서 모터 뉴런의 활동을 차단하여, 우리는 모터 신경 자체의 활동이 모터 출력 신호의 전파해야하는지 여부를 테스트 할 수 있었다. 모터 뉴런의 지역 및 과도 봉쇄 연동 운동의 전파를 체포. 봉쇄가 제거 된 후, 프로pagation는 파도가 체포되었다 세그먼트에 나타났다. 이 현상은 모터 신경 세포의 활성화없이 propagative 파가 더 복부 신경 코드를 따라 진행 할 수없는 제안, 따라서 모터 뉴런의 활성화는 연동 운동이 필요합니다. 우리는 이전이나 다 등. (2011) 13 자세한 데이터와이 현상에 대해 토론을보고했다. 여기, 우리는 해부 애벌레의 움직임을 모니터링하면서 대화식으로 신경 활동을 교란하는 방법을 설명합니다. 다양한 GAL4 라인과 활동 조작을위한 시공간 패턴의 시리즈를 사용, 하나는 모터 회로의 교란 응답 속성을 통해 회로 논리를 조사 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BX61WI Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV1000 confocal system</td><td>Olympus Corporation</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Sony</td><td>XCD-V60</td><td></td></tr><tr><td>all-trans retinal</td><td>Sigma</td><td>R2500-500MG</td><td>200 mM stock in 95% EtOH</td></tr><tr><td>Silpot184</td><td>Dow Corning Toray</td><td>3255981</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

초파리 유충의 운동력이 1-6 회로의 기본 연결을 구성 요소의 유전 접근의 미덕에 의해 개발 및 생리적 신경 과학의 훌륭한 모델 시스템입니다. 애벌레 신경 회로의 optogenetics 7,8의 응용 프로그램은 우리가 공간적 패턴 방법 9-13에 신경 활동을 조작 할 수 있습니다. 일반적으로 표본을 광범위 수은 램프 조명 LED를하는 경우, 대상 뉴런 너무 특이성 등 GAL4-UAS 시스템 14,15 같은 이진 유전자 발현 시스템에 의해 제어됩니다. 이 작품에서 &quot;하위 유전 해결 방법&quot;에 대한 공간 분해능을 향상시키기 위해, 우리는 로컬로 기존의 공 초점 현미경에 구현 된 레이저를 사용하여 복부 신경 코드의 뉴런의 하위 집합을 조명. 반 그대로 유충의 몸을 벽의 움직임을 모니터링하면서, 우리는 대화 형으로 활성화 또는 channelrhodopsin 16,17 O와 신경 활동을 억제각각 R halorhodopsin 18-20. 신경 조직의 공간적 및 시간적으로 제한된 조명함으로써, 우리는 행동의 특정 단계에서 회로의 특정 뉴런의 활동을 조작 할 수 있습니다. 이 방법은 복부 신경 코드를 로컬 신경 조립 및 모터 출력의 시공간적 패턴의 활동 사이의 관계를 연구하는 데 유용합니다.

<html> ChR2와 모터 뉴런의 지역 및 과도 활성화. 우리는 모터 뉴런에 ChR2을 표명했다. 각 VNC 세그먼트 프로젝트에서 몸을 벽의 해당 세그먼트에 새로운 모터 뉴런의 축삭. 우리는 블루 레이저로 VNC 중 하나 또는 두 개의 세그먼트를 자극하면 해당 세그먼트의 근육이 수축 (그림 1) 전시. NpHR와 모터 뉴런의 지역 및 과도 억제. 우리는 모터 뉴런 NpHR을 표명했다. 우리는 연동 근육의 수축하는 동안 노란색 레이저 VNC의 몇 가지 (1 ~ 2) 세그먼트를 자극 할 때, 전파 전파은 신체 벽의 해당 부분 (그림 2)에서 체포되었다. 우리는 레이저 조명 13 꺼질 때 다음 파도가 체포 세그먼트에서 다시 시작됩니다. 50513fig1.jpg &quot;고도 =&quot;그림 1 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot;5.5in &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; 그림 1. ChR2와 모터 뉴런의 지역의 활성화. 필렛 준비의 지역 활성화 A. 체계. 모터 뉴런에 ChR2을 표현 복부 신경 코드의 몇 부분의 푸른 빛 조명으로, 해당 분야에서 근육 (화살표 머리) 계약을 체결하고 있습니다. 해부 유충의 B. 전송 이미지. 복부 신경 코드 지역의 조명 (화살표 머리) 체벽의 근육 (화살표)의 분절 수축을 유도합니다. <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> 그림 2. 필렛 준비의 로컬 억제 NpHR. A. 제도와 모터 뉴런의 지방 억제. 노랑 L 님모터 뉴런, 자발적-발생한 연동 운동 (상단에 화살표 머리) 동안 근육 수축 완화에 NpHR을 표현 복부 신경 코드의 몇 가지 세그먼트의 광명 조명 해부 유충 (바닥에 화살표 머리). B. 변속기 이미지 . 복부 신경 코드 (화살표 머리) 지역의 조명 자발적으로 계약 한 몸 벽 세그먼트 (화살표) 완화.

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명<em&gt; 초파리</em&gt; 기존의 공 초점 현미경 내에서 레이저를 사용하여 유충. 이 기술은 모터 회로의 역학을 설명하기 위해 몇 neuromeres의 신경 활동 지역의 섭동을 달성하기 위해 연구자 수 있습니다.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K 조회수.  The University of Tokyo. 준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명 초파리 기존의 공 초점 현미경 내에서 레이저를 사용하여 유충. 이 기술은 모터 회로의 역학을 설명하기 위해 몇 neuromeres의 신경 활동 지역의 섭동을 달성하기 위해 연구자 수 있습니다.

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Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

연구

생물학

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

신경과학

초파리에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

저자 스포트라이트: Drosophila Embryos의 상피 장력 측정과 결합된 Rho1 매개 Actomyosin 수축성의 광유전학적 억제  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

발생학

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

신경계 적응 연구를 위한 초파리 의 단일 뉴런 절제

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. Using this non-invasive method, the developing nervous system can be manipulated in a cell-specific manner. Disrupting the development of individual neurons in a network can be used to study how the nervous system can compensate for the loss of synaptic input. Individual neurons were specifically ablated in the giant fiber system of Drosophila, with a focus on two neurons: the presynaptic giant fiber (GF) and the postsynaptic tergotrochanteral motor neuron (TTMn). The GF synapses with the ipsilateral TTMn, which is crucial to the escape response. Ablating one of the GFs in the 3rd instar brain, just after the GF starts axonal growth, permanently removes the cell during the development of the CNS. The remaining GF reacts to the absent neighbor and forms an ectopic synaptic terminal to the contralateral TTMn. This atypical, bilaterally symmetric terminal innervates both TTMns, as demonstrated by dye coupling, and drives both motor neurons, as demonstrated by electrophysiological assays. In summary, the ablation of a single interneuron demonstrates synaptic competition between a bilateral pair of neurons that can compensate for the loss of one neuron and restore normal responses to the escape circuit.

저자 스포트라이트: Investigating the Mechanisms of Neural Circuit Assembly and Synapse Formation in Drosophila

This protocol demonstrates the laser cell ablation of individual neurons in intact Drosophila larvae. The method enables the study of the effect of reducing competition between neurons in the developing nervous system.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동

요약

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이 비디오의 챕터

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 자극 Drosophila 신경근육학 분기점

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동

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Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

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Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 자극 Drosophila 신경근육학 분기점