저자가 도움이 덧글에 대한 박사 알리스 테어 Garratt을 (최대 Delbrück 센터, 베를린) 감사하고 싶습니다. 이 작품은 독일 연구 협회 (DFG)의 공동 연구 센터 (SFB665)에 의해 지원되었다.

1. 해부 절차 참고 : 마우스의 실험적 사용이 공식적으로 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침을 승인 따라야합니다. <ol><li> 준비하기 전에, 해부 현미경을 설정하고 집게를 (내부 - 광택 조언을 두 중) 해부 크고 작은 가위, 큰 톱니 포셉, 곡선 포셉 및 뒤몽 제 5의 4 세트를 포함하여 해부에 필요한 수술 도구를하다 ( 자세한 내용은)는 특정 시약 및 장비의 테이블을 참조하십시오. 100 mm Sylgard - 코팅 배양 접시에있는 필터 종이를 놓습니다. 12 잘 판, 100 mm 페트리 접시와 12 ML 관의 우물에서 차가운 PBS를 붓고 얼음을 두십시오. 얼음 두 번째 12 잘 플레이트와 장소의 각 우물에 고정 버퍼의 피펫 2ml (PBS, pH를 7.4에서 4 % paraformaldehyde). </li><li> anesthetization 후, E12.5 (질 플러그 감지 E0.5로 지정)에 초과 임신 댐을 희생, 마우스를 장소세 종이 수건의 시트 및 70 % 에탄올로 복부 영역을 흡수에 미치는 복부 측면까지 함께. </li><li> abdominopelvic 구멍을 열고, 양국 자궁 뿔을 분리하고 차가운 PBS로 100 mm 요리 중 하나에 그들을 전송합니다. </li><li> 미세한 통제, 소형, 바로 가위로 이번에는 질 벽에의 세로 절개를하고 태반에서 각 amniotic SAC 버려야. </li><li> 벗겨내는 amniotic 각 배아에서 SAC와 탯줄은 자르고. </li><li> 작은 가위를 사용하여 배아를 참살하고 genotyping가 필요해야하는 경우 게놈 DNA의 격리를 위해 별도로 머리 또는의 일부를 넣어. 그 후, 차가운 PBS로 12 잘 판의 각 우물에 torsi을 전송. </li><li> PBS 몇 방울로 Sylgard 접시에 필터 용지를 습식 및 종이의 지느러미 측면과 배아 몸통을 위치. 더 나은 안정성을 위해, 시체에서 떨어진 꼬리와 사지를 펴. </li><li> 일하는약 16X의 확대와 해부 현미경, 신중하게 좋은 밀고 집게의 두 쌍이있는 척수 위의 배아의 피부를 꼬집어 부드럽게 그것을 갈가리 찢어. 중간에부터 꼬리 방향으로 첫째 진행 후 앞쪽에 편으로의 중간에서 다시 시작. </li><li> 건조하지 않도록 PBS의 두세 방울과 함께 수시로 배아가 젖었어. </li><li> 그것이 내부 - 광택 팁을 벌금 포셉의 날개와 수평 슬라이딩 운동에 의해 주변의 연골이 척추 칼럼에서 DRG와 척수를 분리 배아에서 제거됩니다 때 DRG를 방지하기 위해이 척수에서 출발 시끄러운 쓰레기 오토바이 경찰입니다. 배의 오른쪽 가운데에 시작, 앞쪽에 끝에 다음 꼬리쪽으로 길을 작동합니다. 그 후, 반대편에있는 절차를 반복합니다. 관련 DRG를 다 뜯어내고하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아에서 완전히 느슨하게 척수를 분리하려면 해당 cervic 데리러야외 미세 집게로 부분과 꼬리 끝 부분 한 조각에서 빼낸다. </li><li> 분리된 척추 고정 버퍼 가득 12 - 음 판의 우물에 첨부 DRG와 코드와 남은 배아에서 척수 코드의 준비와 진행 잠수함. </li><li> 척추 코드에게 얼음에 적어도 두 시간을 수정. </li></ol> 2. DRG의 뉴런의 DiI - 라벨링 <ol><li> 표시되는 각 척수 들어, micropipette를 끌어당기는 두 개의 유리 바늘을 준비합니다. ..., 2 열 = 600 벨 = 25 시간 = 175, 3 열 = 630, 벨 = 1 열 = 625, 벨 = 35 시간 = 175 : 우리는 셔터 모델 P - 97 전극 풀러 (프로그램 설정을 사용 30 시간 = 150). </li><li> 미세한 통제하에 3-5 시간은 에탄올에 DiI의 5 % (W / V) 솔루션의 각 유리 바늘의 끝부분을 찍어. 에탄올의 증발은 바늘에 DiI 크리스털의 얇은 레이어를 만듭니다. </li><li> 약 40x의 배율과 해부 현미경 작업, 그 V와 척수를 배치슬라이드에 entral 측면까지. 스프링 가위를 사용하여 나중에 (섹션 C를 참조) 거꾸로 개방 책 모드에서 준비 장착 있도록 floorplate을 통해 절단하여 전체 길이의 복부 측면에있는 코드를 엽니다. </li><li> 슬라이드에 지느러미 측면과 척수를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세한 시각화에서 유리 바늘의 DiI 덮인 팁 및 척수의 한쪽 신중하게 피어스는 매초마다 DRG와 코드를 접근한다. DiI의 거의 흔적은 뉴런만이 소수의 라벨을 보장하기 위해 뚫었 DRG에서 볼 수 없습니다. 코드의 다른 측면에 대한 두 번째 바늘을 가져가라. 단 매초 DRG를 목표로하는 것은 개별 axons의 차별 복잡 수도 인근에서 DRG 분류 axonal 계획의 중복 방지. </li><li> 최소한 6 주위 온도에서 시간 또는 4 하룻밤 동안 짙은 어둠 속에서 고정 버퍼와 부화 척수를 반환 ° C가 디로 염색 시간을주고플라즈마 막 내의 축삭을 따라 ffuse. 척수에 부수적인 성장의 분석이 필요한 경우 긴 잠복기 (4 시에하는 데 이틀 ° C)에 대한 허용합니다. </li></ol> 3. 마운트 및 현미경 분석 <ol><li> 그 지느러미 면을 하나의 척수는 PBS의 드롭에서 coverslip에 아래 염료 확산, 위치 다음. 첨부된 DRG가 옆으로 올바르게 지향적이며, 뒤섞이다하지 않는 조심해. 초과 액체를 기음과 집게를 사용하여 거꾸로 오픈 책을 모드에서 코드를 버리고. </li><li> PBS를 사용하여 현미경 슬라이드에 대한 준비를 탑재합니다. </li><li> 분류 axonal 계획의 불필요한 배경 얼룩 형광 현미경 분석의 증가를 방지하기 위해서 마운트의 하루를 실시한다. 다음 4 어둠의 슬라이드를 유지까지 ° C. </li></ol> 4. 대표 결과 : 마우스의 척수는 수입 성의 PR를받습니다자궁 경부의 8쌍에서 ojections, 흉부의 13쌍, 60 척추 신경에 총 성례의 DRG의 요추와 4쌍 5쌍. 훈련 후에도 연결된 대부분의 DRG와 척수는 5 분 안에 배아에서 격리 수 있습니다. 이 절차는 E11.5에서 E13.5 마우스 배아에 연결된 DRG와 척수 코드의 격리에 적합합니다. 그러나, 최상의 결과는 E12.5에서 달성하고 있습니다. 여기에서 설명한 상표 절차의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 척수의 전체 길이 이상의 DRG의 라벨은 다음 여러 척추 레벨 (그림 4)에서 axonal 분기 동작을 계량하는 데 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> 그림 1. 제도 axonal 분기의 두 주요 모드를 묘사. 여기에 표시된대로 - - (A) 분기점으로 이어질 수 성장 원추의 활동에 의해 분기뿐만 아니라 복잡한 터미널 arbors 또는축삭 샤프트에서 (B) 부수 형성 (중간 분기). 후자 모드는 6,7 대뇌 피질과 thalamocortical axons을 예상의 지배 분기 유형입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> 그림 2 배아 척수로 DRG 뉴런의 수입 성의 전망은 axonal 분기 두 가지 유형의 표시 :. 분기점에 의해 DREZ (1)에서와 중간 분기 (2)에 의해 대기 기간 후에 발생하는 딸 지점의 민간인 피해 양식에서 axons 첫번째 지점을. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> 그림 3. 배아 마우스 DRG의 신경의 단일 axonal 궤도의 시각화. (A) 첨부 DRG와 척수는 E12.5 마우스의 배아에서 준비했습니다. 증가 확대에 야생 형 생쥐의 DiI - 레이블 DRG의 (스케일 바, 1mm.) (BD) 등의 전망이 표시됩니다. B의 모든 초 DRG는 labele입니다DiI로 D. 형광 이미지가 거꾸로 있으며, 꼬리는 왼쪽에 있으며, 측면 C와 D에서 맨 아래에 있습니다. C에서 axons의 작은 번호가 표시되고 더 높은 배율에서 T와 같은 가지의 존재는 척수의 DREZ에서 확인할 수 있습니다. (스케일 바, 250 μm의 (B), 100 μm의 (C)와 50 μm의 (D).) <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> 그림 4. T - 모양의 가지, 야생 형에서 단일 주동이의 혹은 꼬리 전환 및 C - 타입 natriuretic 펩티드 (CNP) - 결함 E13.5에서 생쥐의 부량. 계산 한 axons의 숫자는 각 유전자형에 대해 서로 다른 트렁크 수준 꺾쇠 괄호로 묶어 주어집니다. C 또는 R은 - 전환 - 전용 꼬리 또는 주동이의 방향으로 성장을, 각각. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> 그림 5. cGMP 신호 통로는 척수의 DREZ에서 감각 축삭의 분기점을 트리거합니다. 의 (A) 제도리간드 CNP, 수용체 guanylyl cyclase Npr2와 세린 / 배아 DRG의 뉴런에서 트레오닌 키나제의 cGKIα 구성된 cGMP 신호 경로. Npr2는 CNP에 의해 자극시 GTP로부터 cGMP 생성합니다. (B) DiI 야생 유형과 CNP - 결함 생쥐의 뉴런을 DRG의 단일 axons의 추적. (스케일 바, 25 μm의.)

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

DiI 라벨에 대한 고정 조직의 사용과 함께 준비의 용이성과 함께 axonal 지점 형성의 두 가지 유형으로 구성된 틀에 박힌 프로젝션 패턴 분기 axonal 연구에 유리한 모델을 DRG 붙어있는 배아 척수를합니다. 코팅 유리 바늘을 사용하여 DiI 미세한의 응용 프로그램이 있습니다 - DRG 뉴런의 작은 그룹의 시각화함으로써 개별 axons과 분기 패턴의 분석 - DRG의 대량 라벨과는 달리 인치 설명한 방법은 더욱 더 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope Stemi DRC </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 용액 (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 머크 </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> 표준 외과 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> 톱니 표준 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 벌금 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 5 번 좋은 팁 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 제 5 미러 마무리 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas - 튀빙겐 봄 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 종이 </td><td> 피셔 과학 </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> 세계 Precission 악기 </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mm 배양 접시 </td><td> Greiner </td><td> 663,102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ML의 폴리 프로필렌 튜브 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 물론 문화 플레이트 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 머크 </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> / 브라운 micropipette 풀러 P - 97을 불타는 </td><td> 셔터 악기 (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI는 (1,1 &#39;- Dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 3&#39; - tetramethyl - 퍼클로레이트를 indocarbocyanine) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 468,495 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 SuperFrost 플러스를 슬라이드 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 풀렸는데 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

여기서 우리는 lipophilic 추적 1,1 &#39;- dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 퍼클로레이트 (DiI 1) 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine를 사용하여 잘 퍼지는 얼룩하여 배아 척수로 DRG 뉴런의 작은 그룹의 탄도를 레이블에 기술을 제시 . 유전자가 변이된있는 마우스 라인의 사람과 야생 타입의 axonal 경로의 비교는 신경 시스템의 배선에 필수적인 메커니즘입니다 axonal 분기의 제어 후보 단백질의 기능 역할에 대한 테스트를하실 수 있습니다. Axonal 분기되므로 정보의 병렬 처리를위한 물리적 기초를 제공하고, 복수의 타겟과 연결하는 개별 신경 세포 수 있습니다. axonal 성장의 중간 타겟 지역에 파급 효과가 터미널 arborization 구분할 수 있습니다. 또한, axonal 지점 형성의 다른 모드는 성장 원추의 활동 (분할 또는 지연 브래지어의 여부 분기 결과에 따라 분류있을 수 있습니다nching) 또는 과정에서 축삭 축에서 민간인 피해의 신진부터 중간 분기 2 (그림 1)했다. DRG에서 뉴런의 중심 예상 axonal 분기 두 가지 유형의 연구를하는 유용한 실험 시스템을 제공합니다 : 자신의 수입 성의 axons시 10 분 13 일 (E10 - E13) 배아 일 사이에 척수의 지느러미 루트 항목 영역 (DREZ)를 도달할 때 틀에 박힌 패턴의 T 또는 Y 형 분기를 표시합니다. 두 결과의 딸 axons 다음 코드의 dorsolateral 여백에서 각각 주동이의 또는 꼬리 방향으로 진행하고 대기 기간 민간인 피해는 특정의 릴레이 뉴런에 회색 물질 (중간 분기) 및 프로젝트를 침투 이러한 줄기 axons에서 새싹 후에만 그들은 더 이상 (터미널 분기) 3 arborize 척수의 laminae. DiI의 tracings은 PR에 나타나 척수의 지느러미 루트 항목 영역에서 성장 콘 감을 잡을수있다그 분기점을 제안 분할의 ocess이 성장 원추 자체 4 (그림 2) 분할로 인해 발생하지만, 다른 옵션은 물론 5 논의되었습니다. 이 비디오는 DRG가 첨부된 떠나는 E12.5 생쥐의 척수를 해부하다하는 방법을 첫째 보여줍니다. DiI의 표본 작은 금액의 다음 고정은 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 DRG에 적용됩니다. 부화 단계 후, 표시된 척수는 형광 현미경을 사용하여 개별 axons을 분석 거꾸로 오픈 책을 준비로 마운트됩니다.

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DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K 조회수.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. 쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

비디오: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

발생학

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

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