1. 프로토콜 세포 배양을위한 멀티 Flasks을 사용하는 <ol><li> 선박의 준비와 세포 현탁액을 추가 <ol><li> 필요에 따라 세포 성장 매체를 준비합니다. </li><li> 멀티 플라스크 세로로 작업 표면 (무균 층류 후드)에 직면하고있는 캡과의 측면에 선. <ol><li> 이러한 flasks 3에서 사용할 수있는 5 층 형식과 T - 175 술병과 비슷한 작업 흐름 패턴을 사용합니다. </li></ol></li><li> 풀어 뚜껑을 제거합니다. 50 또는 100 ML의 피펫을 사용하여 플라스크 내부 또는 외부로 쏟아져 사전 예열 매체의 필요한 금액을 추가합니다. <ol><li> 멀티 Flasks이 모자가 위쪽을 향하고와 세로로 배치하는 경우 ≤ 10 ML은 선박의 바닥에 도달할 수 있습니다 아르 Pipettes. Pipettes ≥ 10ml 이는 선박 미디어의 큰 볼륨을 추가할 수있는 편리한 포털을 제공, 멀티 술병에있는 로고 과거 즉시 혈관에 도달할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 매체의 버블링을 피하기 위해, FL에 액체 스트림을 허용멀티 술병의 뚜껑 (로고 쪽)의 내벽을 따라 오우. </li><li> 10 ML 피펫 및 캡 flasks을 사용하여 상위 계층을 통해 성장 매체에 집중 세포 주식의 세포 현탁액을 추가합니다. 도움말 : - 교통 인큐베이터 사이트에 카트 멀티 Flasks하고 나머지 단계를 수행합니다. - 셀 시딩 밀도는 셀 유형, 매체 및 문화 기간이 필요에 따라 달라집니다. 표준 T - 175 flasks에서 사용하는 시딩 밀도와 미디어 볼륨으로 시작하여 형식이 사용되는 다중 술병에 따라 3 또는 5 곱하면됩니다. </li></ol></li><li> 세포의 혼합 <ol><li> 위치를 믹스 : 로고가 직면하고 함께 똑바로 멀티 휴대용 술병을 잡고 카운터 45 ~ 시계 방향 각도 당신을 마주 믹스 포트. </li><li> 같은 각도에서 개최, 부드럽게 상단 레이어의 액체까지 (당신을 멀리 목) 앞에서 뒤쪽으로부터 멀티 휴대용 술병을 기울 것은 완전히 소모될 downwar믹스 포트를 통해 DS. 믹스 포트쪽으로 돌고. </li><li> 마찬가지로, 부드럽게 중간 완전히 혼합 포트를 통해 상단을 향해 아래쪽 레이어에서 하수구까지 뒤에서 앞에서 (당신쪽으로 목)에 다중 휴대용 술병을 바위. 단계 1.2.2과 적절한 혼합을 보장하기 1.2.3 한 번 더 반복합니다. </li><li> 다시 믹스 위치 (1.2.1 단계)에 멀티 휴대용 술병을 지참하고 1.3 단계로 진행 </li><li> 또는 세포 현탁액은 멀티 술병에서 외부 준비할 수 있으며, 세포 현탁액은 피펫을 사용하여 혈관이나 부드러운 쏟아져하여 추가할 수 있습니다. <ol><li> 믹스 포트는 미디어와 세포의 인 - 선박은 혼합 수 있으며 외부 세포 정지의 큰 볼륨을 만들 필요가 없습니다. </li><li> 또한 멀티 술병의 레이어에 걸쳐 미디어 등화 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> 유체의 평균 <ol><li> 혼합 / 세포 현탁액의 추가 후, 장소 멀티 플라스크 수직 평면 작업 표면에 액체 볼륨 equa를 맞춰야베드로 모든 레이어 인치 </li></ol></li><li> 각각의 레이어로 분할 액체 <ol><li> 당신이 직면하고있는 로고와 함께 멀티 휴대용 술병을 잡고 레이어의 각 파티션에 45 ° 각도 액체 시계 방향으로 회전. 팁 : - 최상의 결과를 얻으려면이 단계 1.3-1.4의 평면 작업 표면을 사용하는 것이 중요합니다 </li></ol></li><li> 수송 <ol><li> 일단 세포 현탁액을 포함하는 미디어 전송 멀티 술병은 같은 45 ° 각도 (시계 방향) 거리에 인큐베이터로 믹스 포트에서 미디어 단계 1.4.1에서와 같이에서 분할됩니다. 현미경에서 볼 배양기에서 flasks를 제거하면이 위치도 적합합니다. </li></ol></li><li> 보육 선반에 멀티 술병 배치 <ol><li> 에서 멀티 휴대용 술병을 들고 45 ° 각도 (시계 방향, 거리 믹스 포트에서), 부드럽게로 믹스 포트에서 거리 모퉁이를 사용하여 (배양기 표면에 가로로 내려 회전피봇). 로고가 직면와 함께 멀티 휴대용 술병을 놓는다. <ol><li> 팔콘 멀티 플라스크 디자인은 선박이 스택을 허용하고 튼튼한 스택 갈비뼈에 의해 장소에서 그들을 보유하고 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 및 시약의 유통 <ol><li> 작업 표면에 평평하게 멀티 플라스크를 삽입 후, 부드럽게 앞뒤로 바위와 사이드 사이드 각 계층에서 액체를 엎지르지 않도록주의를 복용 문화 표면에 균일하게 세포를 배포할 수 있습니다. flasks를 스택. <ol><li> 이 플라스크는 광학 명확 물질로 만들어져 있으며 마지막 레이어에 세포는 쉽게 현미경에서 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 미디어 교환 <ol><li> 기음하는 동안 직면하고있는 로고와 함께 왼쪽으로 기울이기는 멀티 술병 (믹스 포트 쪽). </li><li> 다음 기울기, 오른쪽에있는 멀티 술병, 모든 잔여 미디어를 대기음을 이어갑니다. </li><li> 미디어의 적절한 금액을 추가하고 단계 1.3-1.7을 따르십시오 </li></ol></li></ol> 2.멀티 Flasks에서 수확 세포 <ol><li> 세포 라인까지 멀티 Flasks 수직을 떼어 놓다 및 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 각 하나를 가지고 있습니다. 부드럽게 미디어 멀티 술병의 상단 레이어 배수 수 있도록 같이 목이 그래서 당신이 직면와 flasks로 바꾸란. </li><li> 당신이 믹스 포트 근처에 액체 수준에 도달할 때까지 목을 통해 5 또는 10 ML aspirating 제보를 넣습니다. 지친 매체 기음. </li><li> 분리 시약 / 세척 버퍼를 추가하고 단계 1.2.1에서와 같이 위치를 섞어 가지고 다음, 진행 및 단계 1.3-1.7를 수행합니다. 성장 매체 / 중화 요원과 함께 중화 및 수신 튜브에 세포 현탁액을 잔 또는 세포가 유출되는 등의 휴대용 술병을 바꾸란 상단 선박의 층 및 10 ML의 피펫을 사용하여 세포를 수집합니다. 팁 : 알에서 미디어의 완전한 배수를 허용하기 위해, 셀 또는 시약의 회복을 향상시킬 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 멀티 휴대용 술병을 가지고, 교환을 향해 목이 반전하기<html> 상단 레이어에 내 계층. 멀티 술병이 바뀌 남아 있고 난 후, 기울기 멀티 플라스크는 45 ° 각도 (거리 믹스 포트에서)를 시계 방향으로. 남은 시약를 수집하는 피펫 (10-10 ML)를 사용합니다. </li></ol> 3. 팔콘 멀티 Flasks에서 권장 작업 볼륨 성장 매체 3 층 : 멀티 플라스크 당 75-150 ML 5 층 : 멀티 플라스크 당 125-250 ML 해리 대리인 3 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 15 ML 5 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 25 ML 팁 : 표준 T - 175 flasks에 사용되는 중간 볼륨으로 시작하고 단위 면적 당되는 ML은 동일하게 유지하므로 평가 멀티 술병에 형식을 따라 3 또는 5 배 곱하면됩니다. 4. 대표 결과 : 팔콘 멀티 플라스크 1. 설계 files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . 그림 1 : 멀티 플라스크의 세포 배양 혈관은 3에서 사용할 수있는 - 그리고 규모 - 업 각각 525과 875cm이 성장 면적을 제공하는 세포의 5 레이어 스택 형식입니다. 피펫 액세스뿐만 아니라과로와 밖으로 혈관의 세포 및 시약의 제거를 용이하게합니다. 믹스 포트의 존재는 멀티 술병의 모든 레이어에 걸쳐 미디어의 급속한에 - 선박 믹싱 및 균등화를위한 수 있습니다. . 2 세포 수율은 멀티 플라스크를 사용하여 : 이러한 선박 3에 해당하고 T - 175 flasks의 5 배 면적 3 계층과 5 계층 형식으로 사용할 수 있습니다. 따라서, ≥ 3과 5 회 (130 ± 6.8 × 10 6 218 ± 23.6 각각 X 10 6 세포) BHK - 21의 숫자 (아기 햄스터 신장)이 세포가 T - 175에 비해 성장 및 멀티 플라스크로부터 복구되었습니다 flasks (43.2 ± 3.5 X 10 6 세포, Fig.2A). U 당 세포 수율알 표면 면적은 3 동등한되었습니다 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21 T - 175 flasks, LnCAP (인간의 전립선 선암 세포 라인), C 형 간염 - G2 (인간 hepatocarcinoma 세포 라인), EcoPack 2-293 (인간 신장 세포 라인)과 같은 세포 공급 업체 (ATCC, 시그마 및 / 또는 Clontech)에서 권장하는 성장 미디어 (레이어 당 35 ML)에서 48 - 96h 기간 (Fig.2B)에 대한 교양. 전지는 자동 바이올렛 - CELL 카운터 (1)에 열거되었다. <img alt="그림 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> 그림 2A : BHK 21 세포의 세 다섯 배 번호가 성장하고 복구되었습니다 3 - 5 - 레이어 멀티 Flasks T - 175 flasks에 비해. 예상 수확량은 컨트롤에서 의미 세포 수율을 사용하여 결정되었다 T - 175 3, 셋, 다섯 번 곱한 flasks - 5 층 멀티 Flasks 각각 (N = 4 flasks / 포맷). <img alt="그림 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/&gt; 그림 2B : cm 2 당 세포 수율은 3 상응하는어요 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21, LnCAP, HepG2 및 EcoPack2 - 293 세포에 대한 T - 175 flasks. 각 막대는 4-6 flasks의 의미 나타냅니다. BHK - 21 세포 (11,000 cells/cm2) 72 시간, LnCAP 전지 (20,000 cells/cm2)와 EcoPack2 - 293 세포 (~ 35,000 cells/cm2)에 대한 교양 있었다가 96시간 및 HepG2 세포 (25,000 세포 / cm 2 교양되었습니다 )는 48 시간 이전에 수확 교양되었습니다. 멀티 플라스크의 레이어 사이 3. 미디어 분포 세포 배양 매체 (DMEM, Invitrogen)는 5 계층 멀티 Flasks (250 mL/5-layer 용기)에 추가 및 프로토콜은 위에서 설명한에 따라 레이어로 분할되었다. 미디어 배포는 개별 레이어에서 밖으로 펌핑 각 계층 및 미디어에 구멍을 천공하여 측정되었다. 각 계층에서 발견한 액체의 무게는 그림 3과 같이 레이어에서 레이어로 비교적 균일한 것으로 판명되었다. 그들은 다음과 같습니다 : 510.8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (GM). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> 그림 3. 5 층 멀티 플라스크의 다섯 가지 레이어의 각 통일 미디어 배포. 세포 배양 매체는 equilibrated 및 개별 레이어로 분할 다중 Flasks (250 ml/5-layer 용기)에 추가되었습니다. 미디어는 개별 레이어와 유체 무게로 뚫고 구멍을 통해 밖으로 펌핑되었다 각 계층 (n은 = 6 flasks)에서 기록되었다. 멀티 플라스크의 층 사이에 4. 세포 분포 셀이 추가되고 멀티 술병 내에서 혼합 수 있습니다. 우리 비즈 (10μm, PolySciences 주식 회사)를 사용하여 다중 플라스크의 층 사이에 세포의 시뮬레이션 배포 세포의 크기와 유사합니다. 비드 정지는 상단 레이어를 통해 10 ML의 피펫을 사용하여 멀티 플라스크 용기로 추가되고 내림차순으로 선박의 미디어 믹스되었다위의 프로토콜 ribed. 비드 배포 비드 서스펜션이 각 레이어에서 밖으로 펌핑되었다 포함된 각각의 레이어와 유체의 드릴링 구멍에 의해 측정되었다. 각 계층에서 발견한 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 읽고 기록했다. 3 계층 멀티 Flasks (Fig.4A)에 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다. 믹스 - 포트 멀티 플라스크 레이어 사이의 세포 및 시약의 균일한 분포를 수 있습니다. <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> 그림 4A : 3 층 멀티 플라스크의 세 가지 레이어의 각 비드 분포. (권, 미디어 볼륨 1시 10분입니다 비드 정지 권)는 구슬의 중지 (3.6 X10 6 / ML)은 멀티 Flasks에 적절 중간에 추가되었으며 혼합, 평균 및 설명된 프로토콜을 사용하여 파티션 단계로 따라갔다. 각 계층 (중간 각 레이어에 구멍을 뚫고 펌프)에서 복구 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운트를 읽어되었습니다어 및 기록. 계층 멀티 Flasks (N = 5 flasks) - 3 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다 아래와 같이 보충 성장 미디어에서 3 계층 멀티 Flasks에서&gt; 80 % 합류로 성장 세포의 Ecopack 2-293 얼룩 패턴을 대표하는 이미지가 있습니다. 세포 monolayers는 고정 및 스테인드 크리스탈 바이올렛과 멀티 플라스크 레이어는 다음 잘린 및 이미지 (2) 스캔했습니다. 참고 셀 patterning는 멀티 플라스크 (Fig.4B)의 모든 레이어에 동질적인되었습니다. 비슷한 결과는 여러 세포 유형 (데이터가 표시되지 않음) 평가와 함께 획득했다. <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> 그림 4B :이 그림은 다중 Flasks의 층 사이에 균일한 세포 성장을 보여줍니다. 3 계층 멀티 Flasks 및 T - 175에서&gt; 80 % 합류로 성장 Ecopack - 2-293 전지는 고정 및 크리스탈 보라색 묻다되었습니다. 멀티 플라스크 혈관이 절단되었고 각각의 스테인드 계층은 스캔했습니다. 5 멀티 플라스크의 공기 공급. : 96시간을위한 교양 EcoPack2 - 293 세포에서 BioProfile 플렉스 분석기 (3,4)을 (노바 의생명)를 사용하는 동안 미디어의 분석 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks (81.03 속에서 자란 세포의 공기 포화에 차이를 알려주지 않았다 ± 1.9 대 83.4 ± 5.8 % 주변 O 2). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> 그림 5 : 동안 미디어의 에어 채도 (% 주변 O 2) 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks에서 미리 혼합 미디어와 유사했다. EcoPack2 - 293 세포는 35,000 세포 / cm 2의 밀도에 씨앗을 품고 사전 미디어 분석 (N = 3 flasks)에 96시간위한 교양되었습니다.

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모든 저자 Becton 디킨슨, Biosciences 세그먼트, 디스커버리 Labware 단위의 직원입니다.

현재 연구는 멀티 술병 디자인 연구자 제공하는 생산성의 증가를 보여줍니다. 멀티 Flasks를 사용할 때 최적의 성능을 위해 위에서 설명한 단계를 수행하는 것이 중요 반면, 가장 중요한 것으로 간주됩니다이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이것은에 파티션 멀티 플라스크 플랫 게시물 누워있는 레이어의 각 (III)에 액체를 분할 후 시계 방향으로 45 °의 각도로 멀티 휴대용 술병을 운반 용기 (2) 이내 믹스 포트를 사용 전지 및 시약의 혼합은 (i) 포함 인큐베이터. 멀티 플라스크의 적절한 사용은 T - 175 flasks (5)에 일치하는 환경에서 양식 각 선박 내에서 균일한 세포 인구의 생산 리드. 이 선박은 T - 175 술병과 비슷한 면적에 3과 5 배 이상 세포를 제공합니다. 3과 5 계층 우주선이 각각 525과 성장 영역의 875cm 2를 제공하고 공간과 노동의 모두를 제공합니다사용자 avings. 조직 문화 표면 처리 따라서 필요없이 스케일 업 가능 표준 flasks 비교 다시 최적화 기존의 문화 조건 또는 품질, 균질성 또는 셀 (6, 7)의 성능을 저하. 이것은 또한 이전에 수집된 데이터 comparability을 위해 제공합니다. 이 선박은 또한 콜라겐과 같은 시약과 코팅 수, 첨부, 성장과 같은 hepatocytes 8, kertainocytes 9, 혈청이없는 미디어 속에서 자란 줄기 세포와 같은 특정 세포 유형의 차별 화를위한 전문 하층을 제공하기 위해 폴리 - D - 라이신, fibronectin 공법. 코팅 솔루션은 이전 culturing 세포에 귀중한 시약의 소모뿐만 아니라 코팅 솔루션의 효과적인 제거를 줄이기 위해 최소한의 잔류 않도록 액체 유지로 제거할 수 있습니다. 레이어 당 25-50 ML로 번역 0.142-0.287 ML / cm 2에서 멀티 flasks 범위의 문화 세포에 권장되는 최적의 미디어 볼륨. 다른 multilayered 플라스크, T 달리그의 제품은 내에서 각 선박의 레이어 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 신속한 수있는 용기에 섞어 포트를 제공합니다. 다양한 세포 라인, 차 문화와 줄기 세포는 멀티 Flasks을 사용하여 효율적으로까지 축소되었습니다. 이 선박은 높은 처리량 - 심사, 백신 생산, 바이러스성 벡터 transfections 및 세포 치료와 같은 세포의 큰 숫자를 요구하는 애플 리케이션에 특히 유리한 있습니다. 시간, 공간, 노동 감소 폐기물 발생의 절감 단일 계층 선박에 종래의 문화 대 멀티 술병의 핵심 위닝 있습니다. 우리 문화 5 수확 세포의 약 세 번 숫자를 수있는, T - 175 3를 사용하여 동일한 공간에 flasks, 5 층 멀티 Flasks. 우주 절약에이 장점은 T - 175에 국한되지뿐만 아니라 다른 선박으로 확장될 수 있습니다 : 일반 실험실 incubators 하우스에 맞는 표준 롤러 병 장치 ~ 4 rol850cm이 표면 영역을 제공하는 각각의 ler 병 (2,200 ML). 같은 영역에서 ~ 20, 5 레이어 다중 Flasks 따라서 문화 전지 다섯 배의 성장 표면을 제공 지내게 될 수 있습니다. 또한, &quot;이동 - 그린 &#39;인식의 증가, 폐기물 생성을 줄이기 위해 옵션이 매우 바람직합니다. 그런 점에있어서, 38 %는 T - 175 flasks 이러한 장점에 비해 멀티 Flasks를 사용하여 폐기물 발생의 감소 리드 (5, T - 175 flasks 한 5 레이어 다중 술병이 ~ 400g 무게 반면에 ~ 640g의 무게)가 있습니다 폐기물 저장 및 처리 비용 및 사용자에게 경제적 절감 결과에 감소합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 세 계층 조직 문화 처리 525cm이 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences의 세포 배양 - BD 팔콘 멀티 Flasks</a> </td></tr><tr><td> 5 층 조직 문화 처리 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,144 </td></tr><tr><td> 100ml 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td> 357,600 </td></tr><tr><td> 10 ML 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td> 357,551 </td></tr><tr><td> 5 ML aspirating 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,070 </td></tr><tr><td> T - 175 플라스크 조직 문화 - 대우 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,028 </td></tr><tr><td> 그램 크리스탈 바이올렛 </td><td> BD </td><td> 212,525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> 시그마 </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI - 1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> 가상 </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Lonza </td><td> CC - 5012 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose 인산 국물 </td><td> 시그마 </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK - 21 세포 </td><td> 시그마 </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> C 형 간염 - G2, LnCAP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 비드 </td><td> PolySciences 주식 회사 </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> 바이오 플렉스 프로필 분석기 </td><td> 노바 바이오 메디컬 </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

셀 기반 애플 리케이션의 증가 세포의 큰 숫자가 필요합니다. 세포의 큰 번호가 필요한 경우 소규모 확장하는 동안 적절 한가 단일 레이어 T - flasks의 사용은, 복잡하고 힘드는 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이 요구를 충족시키기 위해, 새로운 다층 세포 배양 용기의 성능이 T - flasks 단일 계층에서 세포 쉽게 규모를 촉진하기이 논의됩니다. T - 175 flasks에 비해 5 - 레이어 형식과 각각의 문화와 완벽하게 세 복구 및 세포의 다섯 번 번호를 사용 - 테스트 flasks 3에서 사용할 수 있습니다. BD 멀티 플라스크의 핵심 기능으로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 각 선박의 레이어 사이 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 일관 환경 거기에 교양 수있는 세포를 만들 수 있도록 신속하게 믹스 / 평균 항구 T - 175 flasks에 합동이다. 이러한 멀티 Flasks의 디자인도 C에 대한 수onvenient 피펫 직접 flasks에 시약과 세포를 추가뿐만 아니라 귀중한 세포 및 시약의 효율적인 복구에 대한 액세스하고 쏟아져에 의한 오염의 위험을 줄여줍니다. 붓는가 pipetting 이상 선호 어플 리케이션 디자인 귀중한 세포 및 시약의 소모를 줄이기 위해만큼 최소한의 잔류 액체 보유를 허용합니다.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

세포 연구에 수단과 증가 역할을하며, 발견과 새로운 치료제의 개발. 우리가 첨부 의존 세포를 성장과 수확에 대한 더 효율적이고 효과적인 방법이 필요 세포의 더 많은이 증가 필요성과. 오른쪽 기능을 Multilayered 술병이 목적를 검색할 수 있습니다.

새로운 Multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Biology

37.5K 조회수.  BD Biosciences. 세포 연구에 수단과 증가 역할을하며, 발견과 새로운 치료제의 개발. 우리가 첨부 의존 세포를 성장과 수확에 대한 더 효율적이고 효과적인 방법이 필요 세포의 더 많은이 증가 필요성과. 오른쪽 기능을 Multilayered 술병이 목적를 검색할 수 있습니다.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

올 Isacson : 파킨슨병을위한 새로운 요법 개발

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Microfluidics를 사용하여 새로운 치료 응용 프로그램 개발

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

샙터 셀 카운터를 사용하여 세포 배양 동안 휴대폰 번호를 결정

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Moxi Z 미니 자동 셀 카운터를 사용하여 포유류 세포 계산, 세포 크기와 세포 건강의 결정

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...