본 연구에서 설명하는 연구가 WAF에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (DEB - 0805818)에 의해 지원 되었음 : AWS와 ID는이 연구는 또한 AWS와 ID 및 IOS - 0920720로하는 AWS, IOS - 0919855로 보조금 IOS - 0845847에 의해 지원되었다 WAF

<html> 1. 신체 크기와 날개의 크기에 변화를 생산하기 위해 양육과 다이어트의 조작 합리적이고 개요. 최종 장기 및 신체 크기의 변화를 생산 개발 규제 프로세스에 스케일링 궁극적으로 관계 경첩의 표현. 이러한 프로세스는 최고의 같은 D.으로 (즉, holometabolous) 완전히 metamorphic 곤충에 회사에서 설명하는 장기 유충 11,15-17 같은 GRUB 내에 undifferentiated &#39;imaginal 디스크를&#39;성장 melanogaster. Drosophila에서 최종 장기 및 신체 크기는 애벌레 단계 동안 성장에 의해 규제되며 그들이 세 번째 애벌레 instar 18 시작으로 eclosion에 대한 최소한의 가능한 중량 (MVW E)를 도달할 때까지 애벌레는 첫 번째와 두 번째 애벌레 instar을 통해 성장합니다. MVW E의 달성 전 기아 성인 eclosion을 방지합니다. 그러나, MVW E에 굶주려 아르 애벌레는 아주 작은 크기에 불구하고, 현실적인 어른을 생성합니다. 이 때문에 개발하는 동안 영양을 감소가 아니라 파리에 있지만 거의 모든 동물 19-21에서 최종 신체 장기의 크기를 줄일 수 있습니다. MVW E 후에 음식 가용성을 조종하여이 달성했지만 pupation가 발생하기 전에, 그것은 크게 변화의 다른 소스를 (예를 들어, 각각의 유전자 변형) 능가 신체 크기의 극한 phenotypic 소성을 유발 할 수 있습니다. <ol><li> 계란은 50 많이 나누어 phenotyped 수 인구의 수집 및 표준 비행 음식 10ml가 들어있는 튜브에 배치됩니다. 산란이 지속적으로 발생하기 때문에, 계란 세 나이 동료를 생산, 사흘 동안 매일 24 시간을 수집하고 있습니다. </li><li> 가장 오래된 일대가 방황하는 단계에 도달하거나 번데기가되다 시작되면, 다이어트 조작이 적용됩니다. 이 시점에서 가장 오래된 일대가 잘 MVW 전자 넘어이며, 막내 일대는 매우 MVW 전자에 인접해 있고 나머지 일대 어딘가에 이런 극단 사이에있다. 따라서이 시점에서 음식의 제거는 가장 오래된 일대에서 남은 일대에서 가장 젊은 일대와 중간 크기의 성인에서 매우 작은 어른 매우 큰 어른을 생산합니다. 40 % 자당 솔루션의 약 5ml 튜브에서 애벌레를 제거하려면 것은 모든 튜브에 추가됩니다. 애벌레를 무료로하려면, 음식은 중간 속도로 설정 흔드는 테이블에서 15~20분에 대한 흥분이다. </li><li> 부동 유충은 좋은 (00) 붓을 함께 자당 솔루션, 젖은 솜 플러그를 포함하는 튜브에 배치하고 번데기가되다 수에서 제거됩니다. 또는 유충이 같은 메틸 셀룰로오스 22로 비 소화 식품 첨가물에 배치 수 있습니다. </li></ol> 2. 신체 크기의 추정 합리적이고 개요. 이전 연구는 흉부의 길이가 전체 몸 크기가 22 이상 프록시보다 적은 것으로 나타났습니다. 대신, 우리는 신체 크기의 조치로 pupal 크기를 사용합니다. 최대 몸 크기는 pupation을 앞에 먹이의 정지에 고정됩니다. 그 결과, pupal 크기 및 성인 몸 크기 23 사이의 긴밀한 상관 관계가 있습니다. <ol><li> Pupae 유리 현미경 슬라이드에 복부 측면을 정렬하고 해부 현미경에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 몇 군데 있습니다. 각각의 이미지는 촬영된 고유 식별 코드를 할당하고 컴퓨터에 디지털 카메라를 연결하는 생중계를 통해 컴퓨터에 전송됩니다. </li><li> 몇 군데 pupae 그 개인의 고유 코드를 표시 비행 음식 1ml를 포함하는 각각의 두 ML의 epitubes, 이동, 가스 교환을 허용하도록 airholes와 구멍이 있습니다. </li><li> Pupal 크기는 pupal 실루엣의 픽셀의 숫자로 추정된다. 기타 크기는 통계도 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 특성 (날개) 크기 추정 합리적이고 개요. 이미지 날개하기 위해, 우리는 &#39;날개 그래버&#39;24, 검문과 몸 살고 anesthetized 비행 직각의 날개를 보유하고있는을 사용합니다. 유리의 두 조각 사이에 누르면, 이것은 날개가 2 차원 개체로 몇 군데 수 있습니다. <ol><li> 파리는 CO 2로 가볍게 anesthetized하고 컴퓨터에 연결된 디지털 카메라가 장착되어 해부 현미경에 날개 그래버의 위치에 배치. </li><li> 날개는 개별의 고유 코드를 아래에 몇 군데와 저장됩니다. </li><li> 날개 크기는 날개 실루엣의 픽셀 개수 또는 한계 고정 명소를 circumscribes 최소 볼록 다각형을 사용하여 추정 수 있습니다. </li></ol> 4. 스케일링 관계 추정 <ol><li> 데이터는 동료를 통해 풀링하지만, 성별로 구분하고 로그 변환됩니다. </li><li> 스케일링 관계는 타입 II (즉, 감소 주요 축) 회귀 (12 리뷰를 참조) 각 그룹에 대한 예상 매개 변수를 사용하여 크기 데이터에 적합하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 십t &quot;&gt; 우리의 다이어트 조작은 본체 크기 (그림 1)과 특성 크기 (그림 2)의 광범위한 생산됩니다. 서로에 대한 로그 변환 특성을 비행하는 것은 주어진 생물 학적 그룹 내에서 covariation 자신의 패턴을 공개하고 스케일링 관계를 피팅 허용 그룹 (그림 3) 설명 스케일링 관계 매개 변수. 추출하는 방법을 신체의 크기와 모양의 비늘이 그룹 전체 크기가 어떻게 형상 covaries의 비교를하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" /> 그림 1. 번데기 다이어트 조작을 통해 생산의 크기 분포의 극단에서 개인 MVW 전자를 달성 후. 실제 pupal 이미지는 오른쪽에 pupal 크기의 측정을 위해 해당 실루엣과 함께 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바 1mm입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" /> 개인 MVW 전자를 달성 후 그림 2. 날개가 다이어트 조작을 통해 생산 본문 크기 분포의 극단에서 가져온. 실제 날개 이미지는 오른쪽에 표시 날개의 크기 측정을 위해 해당 실루엣과 함께 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바 1mm입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" /> 그림 3. Drosophila melanogaster 섹스에 대한 윙 - 바디 크기 조절. 애벌레로 한 (회색 원) 하루나 이틀 (오픈 원)을 굶주린 완벽하게 공급 (어두운 원) 였는데 각 성별의 개인 로그인 변환 데이터입니다. 타입 II의 회귀 선은 각 섹스에 표시됩니다. 각 연령 일대 사이의 평균 날개 면적 감소 ~ 0.1mm (~ 7 %)와 ~ 0.2mm (~ 8 %), 발생 관찰 phenotypes의 전체 범위를 증가. regressions는 수컷 (경사면 1.06) 약간 hyperallometric 반면 여성이 스케일링 관계 (0.96의 기울기)에 대한 약간 hypoallometric있는 것으로 밝혀.

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-size+regulation:+Combining+genetics+and+physiology.">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li><li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta.">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li><li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+basis+of+reaction+norms:+The+interaction+among+growth+rate,+the+duration+of+growth+and+body+size.">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li><li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster.">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).</li><li>Colombani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth.">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li><li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+assessment+and+growth+control:+How+adult+size+is+determined+in+insects.">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li><li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors.">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li><li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth,+Plodia+interpunctella.">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li><li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects.">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li><li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+basis+of+allometry+in+insects.">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li><li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+to+phenotype:+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects.">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

형태학의 스케일링은 거의 세기 진화 생물학 강렬한 연구의 대상이되고있다. 최근 성장과 확장의 규정에 인접한 기초 개발, 생리 및 유전학 (예 : 12,15,23-25의 리뷰를 참조) 점차 중요 해지고있다. 우리의 방법은 특성과 신체 크기의 전체 범위에 걸쳐 형태학의 스케일링 관계의 추정을 수 있습니다. 특징 크기가 본문 크기 (예 : 13,14)와 선형 규모하지 않을 수 있듯이, 중요합니다. 동물에만 이상적인 실험실 조건 하에서 reared하는 경우 그러나, 이것은 명백한되지 않을 수 있습니다. 우리 프로토콜은 Drosophila의 날개 - 바디 크기 조절 관계의 추정을 허용하도록 명시적으로 개발되었지만, 그것은 파리에있는 형태학의 특성에 대한 스케일링 관계를 추정 특성 특정 수정과 함께 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 다이어트 조작 가능성이 다른 완전히 metamorphic 곤충의 특성과 신체 크기의 전체 범위를 생산하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 응용 프로그램은 단순히 MVW 전자가 달성되었을 때 알고 있으며 ontogeny에 그 시점에서 조작을 적용합니다.

experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in drosophila

신체 부위의 스케일링은 동물 형태 1-7의 중심 기능입니다. 종 이내, 형태학의 특성이 제대로 작동하려면 유기체를위한 몸 비율이해야 할, 큰 개인은 일반적으로 큰 신체 부품과 작은 개인 일반적으로 작은 신체 부위가 있고, 그러한 것이 전반적인 몸 모양은 성인 몸 크기의 범위에 걸쳐 유지됩니다. 정확한 비율에 대한 요구 사항은 종 내의 개인은 보통 상대적인 특징의 크기에 낮은 변동을 전시 것을 의미합니다. 반대로, 상대적인 특성 크기 종 사이 크게 다를 수 있으며 형태학의 다양성을 생산하는 기본 메커니즘입니다 수 있습니다. 비교 작업을 한 세기 이상이 내부 및 이종 간의 패턴 3,4를 설립했다. 아마도 이런 변화를 설명하기 위해 가장 널리 사용되는 방법은 allometric 방정식을 사용하여 두 형태학의 특성의 크기 사이의 스케일링 관계를 계산하는 것입니다 Y = bxα, x와 y가 같은 장기 및 신체 크기 8로 두 특성의 크기가 어디 9. 모두 크기가 다양으로이 방정식은 두 특성 사이의 시간 - 그룹 (예, 종, 인구) 확장 관계를 설명합니다. 이 방정식 로그인 변화가 간단한 선형 방정식을 생성, 로그 (Y) = 로그 (B) + αlog (X)와 같은 종류의 개인 사이에 서로 다른 특성의 크기의 로그 - 로그 플롯은 일반적으로 도청과 선형 스케일링을 공개 로그 (B)와 α의 경사의 &#39;allometric 계수&#39;9,10했다. 그룹 간의 형태학의 변화는 주어진 특징 쌍을위한 확장 관계 교차 또는 경사면의 차이에 의해 설명되어 있습니다. 따라서, allometric 방정식 (B와 α)의 매개 변수의 변화는 우아하게 (11,12 참조) 이내 및 생물 학적 그룹 간의 장기 및 신체 크기의 관계에서 캡처된 형태 변화에 대해 설명합니다. 모든 특성들이 서로 혹은 따라서 신체의 크기 (예 : 13,14)와 선형 규모 아니라, 형태학의 확장 관계는 데이터가 특성 크기의 전체 범위에서 촬영한 때 가장 유익한 있습니다. 여기 우리는 다이어트의 간단한 실험 조작이 곤충의 몸 크기의 전체 범위를 생산하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이것은 크기와 생물 학적 집단 간의 스케일링 관계 매개 변수의 강력한 비교 형상 covaries하는 방법의 전체 설명을하므로 특성의 주어진 쌍을위한 전체 배율 관계의 평가를 허용합니다. 우리가 Drosophila에 초점 있지만, 우리의 방법론은 거의 모든 완전히 metamorphic 곤충에 해당한다.

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Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

형태학의 스케일링 관계는 캡처 organismal 모양을 설명합니다. 우리는 완전히 metamorphic 곤충의 몸 크기의 자연 범위에 걸쳐 형태학의 스케일링 관계를 측정하는 방법을 제시한다. 우리는 모양과 크기가 공동 다양 어떻게 정확한 설명을 허용, 특성 크기의 분포를 증가하는 간단한 다이어트 조작을 사용합니다.

의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 Drosophila</em

The scaling of body parts is a central feature of animal morphology1-7. Within species, morphological traits need to be correctly proportioned to the body ...

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

13.7K 조회수.  University of Houston. 형태학의 스케일링 관계는 캡처 organismal 모양을 설명합니다. 우리는 완전히 metamorphic 곤충의 몸 크기의 자연 범위에 걸쳐 형태학의 스케일링 관계를 측정하는 방법을 제시한다. 우리는 모양과 크기가 공동 다양 어떻게 정확한 설명을 허용, 특성 크기의 분포를 증가하는 간단한 다이어트 조작을 사용합니다.

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

조직 공학 실험 접근법

연구

생물학

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

무척 추 동물 모델 시스템으로 독성 테스트 실험실에서 초파리 를 사용 하 여 실험 프로토콜

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

의 형태학의 스케일링 관계를 추정 바디 크기의 실험 조작 Drosophila

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