우리는 plasmids과 효모 종자를 제공 S. 법석 로버트슨과 E. Heidenreich 감사, P. 팜과와 MF 굿맨 도움이 withthe TLS 분석하십시오. 이 작품은 노화 연구 부여에 대한 미국 연맹에 의해 그리고 NIH AG20642, AG025135에 의해 부분적으로 지원되었다.

두 수명 모델은 미국에서 노화 연구에 사용되고있다 cerevisiae : RLS와 CLS. replicative (신진) 수명 (RLS)은 효모 어머니 세포가 분열 3-6의 유한 번호를 받아야한다는 관찰에 기반을두고 있습니다. 우리는 연대기 수명 (CLS), 문화, 또는 접시 7-11에 비 나누어 효모의 연대기 생존을 기반으로하는 모델에 초점을 맞출 것이다. 와일드 타입 효모가 합성 덱스 트로 오스 완료 (SDC) 매체 10-12시간에 대한 기하 급수적으로 증가 . 포도당 수준이 감소하면 발효 효모에서 호흡하는 스위치는 프로세스 diauxic 변화를 칭했다. 세포는 G 0 체포를 입력하기 전에 약 48 시간 이후 diauxic 단계에서 천천히 분리를 계속합니다. 세포의 대사 속도는 하루에 5-6 (매일 0 접종 일입니다)까지 높은 남아 있습니다. 시간이 지남에 따라 세포 생존 능력은 G 0 체포 및 양식 풍부한 YPED 접시에 식민지를 종료할 수 있습니다 이틀 샘플 날짜순으로 노화 세포의 비율,에 의해 액세스할 수 있습니다. 1. 액체 문화 효모 연대기 수명 (CLS) <ol><li> 1 ML 합성 전체 포도당 매체 (SDC, 표 1)에 하나의 식민지를 예방하고 30 (220 RPM) 잡고 밤새 품어 ° C. 독립 식민지에서 세 inoculums는 생물 학적 복제본을 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비를해야합니다. </li><li> OD 신선한 SDC 매체 (보통 10 ML)에 야간 문화를 희석 = 0.05-0.1 (~ 1:100 희석)와 30 (220 RPM) 잡고 품어 ° C. 이 시점은 연대기 노화의 일 0으로 간주됩니다. 적절한 통기 수 있도록 문화 / 술병 볼륨 (10 ML의 50 ML의 문화, 또는 이상 / 대형 실험 125 ML 25 ML 문화에 대한)의 1시 5분 비율을 유지합니다. </li><li> 3 일부터 시작, 술병에서 10 μl 2 aliquots 제거 YEPD (1 % 효모 추출물, 2퍼센트 bacto 펩톤, 2 %의 덱스 트로 오스에 autoclaved 물, 10 μl 희석 문화 (즉, 10 4 -10) 10,000 번 희석 2 %의 한천) 접시, 그리고 연합 (CFU)를 형성 식민지가 계산되기 전에 48~72시간 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 3 일 CFU는 100 % 생존 간주됩니다. 이후 일 노령화 문화의 희석 요인은 CFU 분석에서 ~ 20-100 식민지 (예, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 세 -10 등)을 보장하기 위해 적절하게 조정해야합니다. DBY746 배경으로 야생 타입 세포 들어, CLS 하루 11 약 1 % 생존에 도달합니다. </li></ol> 현장 생존 분석에의 변형은 다음과 같습니다 : <ul><li> 포도당 제한으로 칼로리 제한 (CR). 포도당 제한 SC 매체에서 밤새 문화 희석 (예 : 대신 표준 2 % 포도당 0.5 또는 0.05 %)를 일반적으로 일 3 낮은 인구 포화 밀도로 연결하지만, 훨씬 수명 12 (10 % 생존) 의미와 최대한의 확장. </li><li> 극단적인 CR / 기아 들어, (물 동일한 볼륨에 resuspend 세포 3 번 반복, 5 분 2,500 RPM에 다운 스핀) autoclaved 물 3 일 정지 위상 문화를 (보통 위의 3 단계에서 10 ML) 씻는다. 물에 Incubationof 세포는 효모는 야생에서 발생할 수있는 기아 상태를 모방한 것이었 지요. 이틀 후, 고령화 문화 autoclaved 물로 세탁하고 lysed 죽은 세포에서 풀려나는 모든 영양소를 제거하는 물 같은 볼륨에서 resuspended해야합니다. 위에 설명된대로 노화 문화를 샘플링하여 생존 분석을 수행합니다. 이 기아 상태는 야생 유형 DBY746 스트레인 12 건 CLS의 거의 두 배로 증가시킨 것입니다. </li></ul> 2. 원위치 생존 분석에서 액체 문화에서 생존 세포의 작은 파편은 세포주기를 다시 입력하고 남은 영양분이나 매체 죽은 세포를 lysed 그 발표 양식을 활용하여 성장 수 표현형는 regrowth를 칭했다 / 13 헐떡이고. 우리는 regrowth / 문제 허걱를 우회하기 위해 DBY746 변형 (trp1)의 auxotrophy을 활용 또한 효모에 대한 다양한 외부 영양분이나 자극의 지속적인 노출이나 박탈의 효과의 테스트를 허용 가능성 - 온 - 어 - 플레이트 시스템을 개발 CLS 11. 현장 생존 분석에서 이것은 세포가 지속적으로 수명 분석 기간 동안 풍부한 영양분에 노출되는 등 replicative 수명 모델을 모방한 것이었 지요. <ol><li> 1 ML 합성 전체 포도당 매체 (SDC)에 하나의 식민지를 예방하고 30 (220 RPM) 잡고 밤새 품어 ° C. 독립 식민지에서 최소한 세 inoculums는 생물 학적 복제본을 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비를해야합니다. </li><li> 문화 ~ 10 8 셀 / ML (OD 600 = ~ 10)로 성장하자, 100-200 cell/10 μl (보통 10 4 배 희석) 1000 cells/10 μl (에 culturewith autoclaved 물을 희석 10 3 배 희석). </li><li> 하나 트립토판 중퇴 SDC 플레이트 플레이트에 희석 문화의 10-30 μl 두 aliquots합니다. 에R 각 변형은 8-20 접시 세트를 준비하고 도금 밀도에 따라 표시 (예, 10 4 배 희석, 판 10 μl 또는 10 4 -10, 10 4 -30, 10 세 -10, 10 세 -30 등), 어떤 10-100 식민지가 노화하는 동안 감소 생존의 기대에 포함 될 수 있도록. </li><li> 수명 분석 기간 동안 30 ° C에서 설정 번호판을 품어. </li><li> 도금의 날짜와 후 매 2 일, 한 판하고 드롭 현명한를 제거 가능한 세포가 성장할 수 있도록 0.5 ML 트립토판 (2 MG / ML)을 추가합니다. 추가 48-72시간 30 ° C에서 번호판을 품어. 트립토판 추가 당일 생존을위한 CFU를 계산합니다. 도금 당일 CFU는 100 % 생존 간주됩니다. </li></ol> 현장 생존 분석에의 변형은 다음과 같습니다 : <ul><li> 한천 플레이트에 대한 연령 전지 (극도의 기아 상태). 추가 1 ML 2X의 성장과 CFU 카운트 14 수 있도록 후속 일 대신 트립토판의 YPED. </li><li> 다양한 탄소 소스, 포도당의 농도 예 : 다양한 (포도당 제한으로 칼로리 제한), 에탄올과 같은 다양한 탄소 소스, 글리세롤, 초산 14 트립토판 합성 중퇴 완전한 매체 접시에 나이 세포. 성장과 CFU 카운트를 허용 1 ML 포도당 / 트립토판 용액 (20 % 포도당과 1mg/ml 트립토판)을 추가합니다. </li><li> 같은 질소와 같은 다른 영양소 조작. </li></ul> 3. 연대기 노화 동안의 DNA 손상과 돌연변이의 빈도 Canavanine 저항 (CAN R) 및 can1 시퀀싱 자연 돌연변이 빈도는 날짜순으로 고령화 사회에서는 canavanine 저항 (CAN R)의 빈도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 플라즈마 아르기닌 permease를 인코딩 CAN1 (YEL063) 유전자,에 돌연변이 다른 시간 지점에서 수집된 아르기닌 아날로그 L - canavanine.Can R 식민지에 강한 세포도 게놈 DNA와 CAN1의 후속 시퀀싱의 추출을 위해 저장할 수 있습니다 렌더링 돌연변이 스펙트럼 데이터 (돌연변이의 서베이와 SoftGenetics) 제공할 수있는 유전자. 자료 대체 (TRP + reversions) trp1 - 289과 함께 계통 TRP1 코딩 순서 호박 변이 (C403T)를 포함하고 있습니다. TRP + 복귀 15 trp1 - 289의 주파수 측정은 효모 연대기 노화 동안 기본 대체 속도의 추정 수 있습니다. 프레임 시프트 돌연변이 LYS - 변형 EH150은 (마타, lys2ΔBglII, trp1 - Δ, his3 - Δ200, ura3 - 52, ade2 - 1o) LYS2 유전자의 Bgl II 제한 효소 사이트를 만들려면 4 세포핵을 삽입하여 만들어진 lys2ΔBgl II의 돌연변이 항구 . 소형 삽입 / 삭제 돌연변이 16-17로 되돌릴 수있는 라이신에 대한 auxotrophy에서 열린 독서 프레임 결과에 결과 4 교대. 총 염색체 rearrangements (GCRs) 총 염색체 rearrangements (GCRs)를 감지하기 위해, 우리는있는 HXT13 (YEL069)이, 매우 중복 hexose 수송을 인코딩, URA3 카세트 18에 의해 중단되었다, 돌연변이 긴장을 생성. HXT13는 염색체 V. 돌연변이에 CAN1에 telomeric 7.5 킬로바이트에 위치해 있습니다 CAN1 및 URA3 유전자 모두에서 각각, L - canavanine 5 - fluoroorotic 초산 (5FOA)로 세포의 저항을 렌더링합니다. 수 R 5FOA R 주파수의 두 유전자 분석에서 발생하는 포인트 변이의 낮은 빈도를 고려하면 GCRs 두 유전자의 손실에 결과의 평가를 제공합니다. 동종 및 homeologous 재조합 동종 거꾸로 반복 (IRS) (pSR406 백퍼센트 중 하나를 수행 : 연대기 나이 중에 동종의 수준 (100 %) 및 homeologous 재조합 (91 %)를 모니터링하기 위해, 우리는 선형의 plasmids (인트론 - IR - URA3 HIS3)이되는 돌연변이를 생성 ) 또는 HIS3 현장 19 국세청 homeologous 91% (pSR407). 국세청 사이의 재조합이 기능 His3 단백질의 표현이 가능합니다. <ol><li> 정상적인 생존 분석 (위에서 설명한 것처럼)에 병렬로, 노화 문화 세포의 적절한 금액을 제거 <ol><li> 수 R 변이에 대해, ~ 2x10 7 세포 (3 일 문화 200 μl)로 시작; </li><li> TRP + 복귀를 위해, ~ 10 8 셀 (3 일 문화의 500-1000 μl)로 시작; </li><li> LYS + 프레임 시프트 돌연변이에 대한 ~ 10 8 셀 (3 일 문화의 500-1000 μl)로 시작; </li><li> GCRs 들어, 2 - 3x10 8 셀 (3 일 문화로부터 2-3 ML)로 시작; </li><li> 동종 및 homeologous 재조합을위한, &amp; 물결표 시작; 5x10 7 세포 (3 일 문화의 200-500 μl); </li></ol> 총 생존의 감소와 고령화 연대기 (표 2)에 돌연변이 빈도의 증가에 따라 도금 금액을 조정합니다. hypermutator의 표현형 (예 : DNA 수리의 결함있는 사람 등) 종자의 경우에는 적절하게 샘플링 금액을 줄일 수 있습니다. </li><li> 펠렛 벤치 - 최고 원심 기계 (5 분 6000 RPM)와 세포. </li><li> 다시 한 ML autoclaved 물, 펠릿 세포에서 세포를 Resuspend. </li><li> 물 100 μl에 Resuspend 세포 펠릿. 플레이트 세포, <ol><li> 에 대한 아르기닌 - 중퇴 합성 전체 중간 접시에 R 변이 (SDC - ARG, 60 μg / ML L - canavanine 황산과 보충)은 수있다; </li><li> TRP + 복귀를 위해, 트립토판 - 중퇴의 접시에 (SDC - TRP); </li><li> LYS + 프레임 시프트 돌연변이에 대해, 라이신 - 중퇴의 접시에 (SDC - LYS); </li><li> GCRs 들어, 아르기닌 - 중퇴의 접시에 (SDC - ARG) 5FOA (1 MG / ML)과 L - canavanine 황산 (60 μg / ML)로 보충; </li><li> 동종 및 homeologous 재조합을위한, 히스티딘 - 중퇴 플레이트에서 갈락토 오스 (2 %)과 보완. </li></ol></li><li> 30 3~4일 &#39;부화 후 CFUs 세어 ° C. 돌연변이의 빈도가 가능한 세포의 개수 표준입니다. </li></ol> 로 보완 현장 생존 분석에서 연령 종속 TRP + 복귀, LYS + 프레임 시프트 돌연변이, 재조합, 또는 R 수도 접시에 이상 세포에서 공부하실 수 있습니다. <ol><li> TRP -, LYS - 그의 - 중퇴, 또는 L - canavanine 합성 전체 중간 플레이트 (위에서 설명한 것처럼)에 플레이트 세포 (~ 10 8 셀 / 플레이트). </li><li> 이틀 (또는 관심의 시점에서) 새로 신흥 식민지 점수. </li><li> 돌연변이 주파수는 특정 일의 가능한 세포의 총 개수에 새로 신흥 식민지를 정상화하여 추정된다. </li></ol> 4. Translesion 합성 (TLS) 연령에 의존 돌연변이의 빈도 증가 증가 macromolecule 손상, 감소 세포 보호 / 복구를 포함하고, 노화 중 잘못된 DNA 수리 (예 : Polζ 종속 translesion 합성, TLS 등) 증가 수 있습니다. 예를 들어, 긴 sch9 Δ의 뮤턴트 SOD2의 강화된 표현을 전시하고, 오류가 발생하기 쉬운 DNA 수리 효소 Rev1 20 표현을 감소. 여기 우리는 체외에서 TLS를 평가하기 위해 손상된 DNA 템플릿 및 전체 핵 추출물을 결합 분석을 설명합니다. <ol><li> 왕 외에 의해 설명된대로 핵 추출물 준비 21;. BCA 분석 (피어스)에 의해 단백질 농도를 계량. </li><li> TLS 버퍼 (20 MM의 HEPES, 7 MM MgCl 2, 1 MM DTT, 25 MM NaCl, 산도 7.8), 200 μMdNTPs 100 nm의를 포함하는 50 μl (최종 볼륨) 반응에 핵 추출물의 0, 5, 10 또는 20 μg 추가 5&#39; - 32 P - 라벨 12 - 메르 입문서이자 DNA의 손상 (5&#39; - TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC를 포함하는 48 메르 템플릿 annealed (5&#39; - CGA TAC TGG GGA - 3 &#39;) ACG GTA CCA TCC TCG - 3 &#39;는있는 X)는, abasic 사이트, 8 - 옥소 - G 등 손상된 사이트, 예를 들어 있습니다. </li><li> 30 혼합물을 품어 ° C 30 분, 2.5 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (20 ㎜)과 proteinase K (10 MG / ML) 2 μl의 추가와 반응을 종료할 수 있습니다. </li><li> 페놀 추출 및 에탄올 강우량과 DNA 정화. </li><li> 겔로드 버퍼의 50 μl에 Resuspend의 DNA (98 % 포름 아미드, 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 염료). </li><li> 19 % polyacrylamide의 젤에 translesion 합성 제품을 해결합니다. </li><li> phosphorimaging (그림 1)를 사용하여 TLS를 계량. </li></ol> 5. 대표 결과 우리는 일반적으로 표준 액체 CLS 분석에 100 % 생존과 같은 일 3 CFU 카운트를 사용합니다. 이후 일 비율 생존는 의미 (50 % 생존)를 계산하기 위해 장착 및 최대 (10 % 생존) 생활은 12에 걸쳐 수 있습니다. 현장 생존 분석에서 얻은 수명 결과는 일반적으로 액체 CLS 분석을 사용하는 사람과 일치이지만,이 부분에서 세포가 지속적으로 영양분에 노출되어있다는 사실로 인해 평균 수명을 감소. 포도당의 존재가 세포 보호 활동 등 Msn2 / 4 Gis1 12 스트레스 응답 전사 인자의 감소로 나타났다 transactivation 억제. 연령 의존 돌연변이의 빈도가 크게 변형 배경, 유전자 조작, 문화 상태, 연령에 따라 다릅니다. 표 2는 야생 타입 변형 (DBY746)에서 얻은 전형적인 결과를 보여줍니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 구성 요소 </th><th> G / L </th></tr><tr><td> D - 글루코오스 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 암모늄 황산 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 질소베이스 (-AS/-AA) </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td></td><td> MG / L </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L - 아르기닌 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L - Aspartic 산 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L - 글루탐산 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L - 히스티딘 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L - 이소 류신 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L - 류신 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L - 라이신 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L - 메티오닌 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L - 페닐알라닌 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L - 세린 </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L - 트레오닌 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L - 트립토판 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L - 티로신 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L - 발린 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> 유라실 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> 표 1. 합성 전체 포도당 매체, SDC (NaOH로 pH를 6.0으로 조정). 히스티딘의 4 배 초과, 류신, 트립토판, 그리고 유라실는 DBY746 변형의 auxotrophy을 보상하기 위해 포함되어 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> 3 일 (± SEM을 의미) </th><th> 최대 (노화 중) </th></tr><tr><td> R 수 </td><td> 1.76 ± 0.12 X10 -6 </td><td> X10 -6 6-8 </td></tr><tr><td> TRP +의 복귀 </td><td> 6.60 ± 1.70 X10 -8 </td><td> X10 -6 1.60 </td></tr><tr><td> LYS + 프레임 시프트 돌연변이 </td><td> 3.00 ± 0.78 X10 -8 </td><td> X10 -6 0.70 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0.62 ± 0.10 X10 -8 </td><td> X10 -6 0.30 </td></tr><tr><td> 상동 재조합 </td><td> 5.55 ± 2.74 X10 -6 </td><td> X10 -6 27.00 </td></tr><tr><td> Homeologous 재조합 </td><td> 0.12 ± 0.04 X10 -6 </td><td> X10 -6 0.48 </td></tr></tbody></table> 표 2. 연대기 나이 중에 야생 유형 세포의 일반적인 돌연변이 주파수 (DBY746). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> 그림 1. translesion 합성 (TLS) 20 결과. 삼일 된 고정 야생 타입 단계 (DBY746)와 sch9 Δ 돌연변이 세포의 핵 추출물은 30 ° C. 30 분 손상 또는 abasic 사이트가 들어있는 DNA의 템플릿 incubated되었습니다 TLS 제품은 고체 (손상되지 않은 템플릿) 또는 점선 (손상된 템플릿) 라인으로 표시됩니다. sch9 Δ의 돌연변이에서 핵 추출물에서 관찰 더 translesion 합성이 없었다. 무료 primers는 열려있는 화살표로 표시됩니다.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants.">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li><li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae.">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast.">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2/Msn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li><li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures.">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner/Bloom+model+system.">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

액체 노화 문화 언젠가 regrowth / CLS 분석을 복잡 허걱 표현형 13, 전시. 인구의 이상 90-99%이 경쟁력을 잃게되면 Regrowth은 일반적으로 발생합니다. 이 표현형은 종종 증가 산화 스트레스 및 / 또는 세포의 감소 방지와 관련된 것입니다. 예를 들어,이 표현형의 빈도가 더 cytosolic 초과 산화물의 dismutase를 부족한 세포에 두 배로 증가보다 크게 긴 돌연변이의 감소 (예 : sch9 Δ 또는 ras2 Δ)이나 돌연변이 overexpressing의 초과 산화물은 22 dismutases. 실제로, 우리는 연대기 노화 동안 높은 사망률 단계에서 3 연속 samplings을위한 생존의 가능성이나 안정화 증가로 regrowth을 정의합니다. 다른 DNA 변이의 연령 종속 주파수가 크게 변형 배경, 유전자 조작, 문화 조건뿐만 아니라, regrowth / 허걱 매우 낮은 생존에 따라 다릅니다. 사전 실험 등 performingthe 전체 규모 수명 분석하기 전에 돌연변이 주파수 범위를 결정하기 위해 돌연변이의 assays 다양한 도금 밀도 의미와 최대 생존과 같은 시간 지점에서 수행되어야합니다. 야생 유형 변형은 항상 어떤 치료 또는 유전자 돌연변이에 병렬로 수명이나 돌연변이의 빈도 연구에 포함되어야하는 상호 실험 - 유사를 설명할 수 수있을 것이다. 여러 생물 학적 복제가 연구에 포함되어야하며, 액체 모두와 현장 생존 / 돌연변이 assays에 결과를 확증하기 위해 실시한다. 대신 조합의 여러 assays을 사용 연령 의존 게놈의 불안정성의 프로 파일링 DNA 돌연변이 중 하나가 특정 유형에 초점을 특정 DNA 손상과 나이 종속 게놈의 불안정성에 기여하는 DNA 손상 복구 시스템 (들)에이 되거 수 있습니다. 예를 들어, 다른 DNA 변이의 사람에 비해 총 염색체 rearrangements (GCRs)에 상당한 증가, 효모 동안 비 동종 결국 elevationof 더블 스트랜드 휴식 및 / 또는 장해 가입 (NHEJ)을 제안 야생 유형 효모의 관찰 연대기 노화 (표 2). 야생 형 노화 효모에서 얻은 can1 돌연변이 스펙트럼은 (CAN1 유전자의 배열) 연대기 고령화 및 오류 발생하기 쉬운 DNA 수리하는 동안 산화 손상을 증가 제안, 반면에, 긴 sch9 Δ의 돌연변이에 더 적은 산화 DNA의 손상 및 많이 감소 오류가 발생하기 쉬운 translesion 합성 20을 관찰했다. 여기에서 설명한 방법은 더욱 연령 종속 게놈의 불안정성을 연구하기 위해 소비하실 수 있습니다. 예를 들어, 정지 및 비 정지 전지는 알렌 외 의해 설명되어있는 밀도 기울기 방법을 사용하여 효모 고정 상 문화에서 격리 수 있습니다. 23. 돌연변이의 assays 여기서 설명과 함께, 우리는 나이에 종속 변이의 많은 부분이 오히려 나누어, 손상되었거나 apoptotic 세포 20,24보다 정지 세포에서 발생보고있다.

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Saccharomyces cerevisiae의 노화 모델을 사용 연구는 부분적으로 높은 eukaryotes 1-2에 보존 아르 수명 규제 경로를 발견했습니다. 효모 노화 모델의 단순화 및 전원도 DNA 손상과 게놈 유지 보수뿐만 아니라 노화 동안 질병에 자신의 기여를 연구 탐험하실 수 있습니다. 여기서 우리는 간단한 DNA와 효모 연대기 수명을 결합하여 기본 대체, 프레임 시프트 돌연변이, 총 염색체 rearrangements, 그리고 동종 / homeologous 재조합뿐만 아니라 핵 DNA 수리 활동을 포함하여 연령에 의존 DNA 변이를 연구하는 시스템을 설명 손상과 돌연변이의 assays. 여기에서 설명한 방법은 게놈 불안정성과 포유류의 나이에 의존 DNA 변이 및 암 기초 메커니즘을 조절 유전자 / 경로의 식별을 용이하게한다.

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Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

여기 노화 동안 규제 또는 게놈 DNA의 불안정성에 기여하는 유전자 / 경로를 연구하기 위해 효모 연대기 수명 모델과 결합 수의 DNA 돌연변이의 assays 집합을 설명합니다.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K 조회수.  University of Southern California, Los Angeles. 여기 노화 동안 규제 또는 게놈 DNA의 불안정성에 기여하는 유전자 / 경로를 연구하기 위해 효모 연대기 수명 모델과 결합 수의 DNA 돌연변이의 assays 집합을 설명합니다.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

게놈 MRI - 게놈 DNA 시퀀스 내의 패턴을 학습에 대한 공개 자료

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

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