우리는 사무엘 셰퍼드, 피터 베이 즐리, 그리고 게놈 MRI 웹 페이지의 관리를위한 욘 다비드 벨 감사합니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 보너스 &quot;인트론 세포의 역할을 조사&quot;에 의해 지원되었다 [부여 번호 MCB - 0643542].

신문에서 모두 사용되는 프로그램은 Perl을 사용하여 작성되었으며, 모든 웹 페이지는 PHP를 사용하여 개발되었습니다. 1. 출발점 : http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /에서 온라인 게놈 MRI 패키지의 홈 페이지를 엽니다. 웹 자원은 또한 &quot;도움말 (How-to/README)&quot;링크를 게놈 MRI 및 이와 유사한 알고리즘에 게시된 모든 자료는 &quot;관련 리소스에 대한 링크&quot;에 나와있는 동안 링크 프로그램에 대한 지침 / 설명을 제공합니다. 2. 준비 및 입력 시퀀스 (들)의 업로드. GMRI 분석 세션을 시작하는 FASTA 형식의 시퀀스 (S)와 파일을 만듭니다. 이 형식의 각 염기 서열이 순서에 대한 간단한 설명하여 동일한 라인에 다음 식별자를 나타내는 &quot;&gt;&quot;문자와 함께 시작하는 하나의 라인과 함께 선행되어야합니다. GMRI 분석을위한 뉴클레오 티드 시퀀스도 R, Y, N, X, 등 Hwever, 비 - A, T, C와 같은 문자를 허용, G 문자는 프로그램에 의해 처리되지 않고 생략됩니다. 반복 요소 ( &quot;N&quot;S로 대체) &quot;마스크&quot;했습니다되는 시퀀스는 입력으로 사용할 수 있습니다. 시퀀스 문자 대소문자를 구분됩니다. <ol><li> 게놈 MRI 홈 페이지에있는 &quot;시작 또는 다시 시작&quot;버튼을 클릭하여 GMRI 세션을 시작합니다. 이 뉴클레오 티드 시퀀스를 업로드할 수있는 페이지로 사용자를 걸립니다. </li><li> 귀하의 FASTA 형식 시퀀스를 복사하여 붙여넣기 또는 &quot;파일을 선택&quot;버튼을 사용하여 로컬 컴퓨터에서 시퀀스를 포함하는 파일을 업로드하십시오. </li><li> 버튼을 &quot;이 파일과 함께 시작하는 새 세션&quot;을 클릭합니다. 확인 메시지는 &quot;당신의 순서가 성공적으로 업로드되었습니다&quot;와 당신은 또한 영숫자 &quot;GMRI 식별자&quot;[사이트이 &quot;세션 레이블 &#39;통화] 세션에 대한 (예 : b16yMj), 받아야한다는 입력 창 위에 표시해야하는 처음 사용 후 최대 2 주가에 대한 세션을 검색하여 계속 사용할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 이제부터의 입력 시퀀스는 &quot;userfile&quot;라고합니다. 3. 입력 시퀀스 (옵션)의 Oligonucleotide 주파수 분포를하십시오. 입력 시퀀스의 집합 전체에 대한 oligonucleotide 주파수의 분배를 위해서는 &quot;SRI 분석기&quot;탭 (상단 행)를 클릭하십시오. 약어 SRI는 단거리 inhomogeneity을 의미합니다. 이 시점에서, 사용자는 주파수가 계산됩니다되는 oligonucleotides 최상의 길이를 (9 세포핵 2까지, 기본 6 국세청에서) 지정할 수 있습니다. 이 선택은 &quot;최대 올리고머의 크기&quot;목록 상자 내에서 원하는 옵션을 클릭하여 이루어집니다. 그럼 계산을 시작하려면 &#39;파일을 분석 &quot;버튼을 누르십시오. 입력 시퀀스 구성의 거친 표현은 바로이 웹 페이지의 중간에 짧은 테이블로 나타납니다와 &quot;userfile.comp.tbl&quot;로 다운로드합니다. 이 테이블은 입력 시퀀스에서만 가장 및 가장 풍부한 oligonucleotides를 나타냅니다. 가능한 모든 oligonucleotides에 대한 전체 주파수 테이블은 &quot;다운로드 구성 파일&quot;링크를 통해 얻을 수있다 &quot;userfile.comp&quot;라는 파일로서 생성됩니다. 참고 : SRI 분석기는 모든 중복 oligonucleotides의 집합 전체로 계산됩니다. 4. 입력 시퀀스 (옵션)에서와 같은 Oligonucleotide 작곡과 랜덤 시퀀스를 생성합니다. (프로토콜의 3 단계의 완공이 작업이 필요합니다.) <ol><li> 임의의 시퀀스를 생성하는 새로운 웹 페이지를 열 수있는 &quot;SRI 생성기 &#39;탭 (상단 행)를 클릭하십시오. 이 웹 페이지에있는 목록 상자를 사용하여 생성하는 임의의 시퀀스의 샘플의 개수를 선택합니다. 이 예제 파일을 각각 &quot;userfile&quot;에 입력 시퀀스와 동일한 번호와 길이의 임의의 시퀀스를 포함합니다. 또한, 입력 시퀀스가​​ 포함되어있는 경우 비 - A, T, C, 또는 G 문자는 임의의 순서는 입력 시퀀스에서와 정확히 같은 위치에서 &quot;N&quot;s를해야합니다. </li><li> 주파수가 랜덤 시퀀스에 approximated 수있는 oligonucleotides의 가장 긴 길이를 선택합니다. 이것은 화면의 중앙에있는 테이블에서 원하는 올리고머 수준 (4 - 기반 oligonucleotides 예 : &quot;4 - mers&quot;)에 대한 라디오 버튼을 선택하여 선택할 수 있습니다. 그것은 임의의 시퀀스는 입력 시퀀스와 같이 선택한 올리고머 수준에서 대략적인 주파수뿐만 아니라 짧은 올리고머 수준의 해당 주파수뿐만 아니라 구성됩니다, 여기서 언급되는 것입니다. oligonucleotide의 작은 변동입력 및 무작위 시퀀스의 주파수가 무작위 시퀀스의 생성에 대한 적용 마르코프 모델 절차로 인해 가능합니다. </li><li> &quot;파일 생성&quot;버튼을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 입력 시퀀스가​​ 큰 경우는 임의의 시퀀스를 생성하기 위해 몇 분 더 걸릴 수도 있습니다. 파란색 &quot;다운로드&quot;링크가이 페이지의 하단에 나타날 때까지 따라서, 사용자가 기다려야합니다. 임의의 집합은 같은 X는 임의의 집합의 개수이고 Y가 선택한 올리고머 수준 (예 : &quot;userfile_rand2_4&quot;)는 &quot;userfile.randX_Y&quot;로 이름을 가진 파일에 배치됩니다. </li></ol> 5. 입력 및 랜덤 시퀀스의 미드 레인지 Inhomogeneity (MRI)의 분석. <ol><li> 시퀀스의 염기 조성의 중형 inhomogeneity를 분석하여 새로운 웹 페이지를 열어 &quot;MRI 분석&quot;탭 (맨 윗줄)를 클릭하십시오. </li><li> 목록 상자 (입력 순서와 임의의 시퀀스의 생성 집합 사이의 선택 여기서 만들 수 있습니다) &quot;분석 파일&quot;에서 분석하는 순서를 선택합니다. </li><li> 제공된 목록 상자를 통해 분석하기 위해 MRI의 콘텐츠 유형을 선택합니다. (세븐 내용 옵션을 사용할 수 있습니다 : G + C, G + A; G + T, A; G, C, 또는 T.) </li><li> 콘텐츠 풍부하고 컨텐츠 가난한 시퀀스가 &quot;창 크기&quot;목록 상자 (; 유효 범위는 30 일부터 1000는 기본적으로 50 세포핵)을 통해 검사됩니다되는 윈도우의 길이를 선택합니다. </li><li> 콘텐츠 풍부하고 컨텐츠 가난한 지역에 대한 상위 임계값과 낮은 임계값을 각각 선택합니다. 이러한 임계값은 (비율 옵션으로 사용) 창에서 현재 윈도우에서 특정 세포핵의 정확한 번호 (목록 상자에 의해 숫자 옵션을 사용) 또는이 세포핵의 비율로 정의할 수 있습니다 </li><li> 다섯 선택합니다 (예 :; 콘텐츠 = GC, 윈도우의 크기 = 50; 어퍼 한계 = 35; 순서 = &quot;userfile&quot;로우어 요건 = 15)를 만든 후에 파일 버튼을 분석 눌러 프로그램을 호출하는 것을 볼 수있다. 이 프로그램은 연속적으로 선택한 입력의 모든 시퀀스를 검색합니다. 각 단계에서 그것은 지정한 창 크기와 같은 길이로 현재 시퀀스의 세그먼트를 획득하고 선택한 내용의 세포핵의 숫자 또는 백분율은 상위 임계값 위 또는 아래 임계값 아래의 여부를 계산합니다. 창이 중 기준와 일치하지 않는 경우, 다음 중복 창이 (염기에 의해 이동) 같은 분석을 위해 선택됩니다. 순서는 내용이 풍부한 또는 가난한 구성에 대한 임계값 요구 사항 중 하나를 충족 어디 창이 발견되면, 프로그램은 출력 파일이 윈도우의 순서를 저장하고 그래픽 출력에 스파이크를 생성합니다. 이렇게하면 프로그램은 다음 아닌 중복 인접한 창으로 점프와 순서의 마지막에 도달할 때까지 스캔 프로세스를 다시 시작합니다. </li><li> 프로그램 완료 후, 출력 파일에 대한 링크 (이름 &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;위의 예를 들면)가 나타나고 그 결과의 그래픽 표현 (그림 1 참조) 웹 페이지의 중앙에 표시됩니다. 아래에 표시된 kilobases의 길이 (KB)로,이 그래픽 디스플레이에 userfile에서 모든 입력 시퀀스는 하나의 문자열로 연결된하고 X 축에 수평 검정 라인으로 발표했다. 입력 시퀀스 따라 모든 콘텐츠 풍부한 지역은 파란색 &quot;상향&quot;스파이크, 그리고 빨간색 &quot;아래로&quot;스파이크와 같은 컨텐츠 가난한 지역으로 표시됩니다. 콘텐츠 풍부하고 컨텐츠 가난한 Windows의 총 숫자는이 그림의 하단에있는 전설 (각각 32 19,)에 parenthses에 표시됩니다. 그림은 상대적인 풍요와 MRI 영역의 배열을 설명하는 역할을합니다. 한편 구체적인 내용은 출력 파일 (그림 3 참조)로 표시됩니다. 이 파일에 내용이 풍부한 또는 가난한 기준과 좌표를 일치하는 모든 뉴클레오 티드 시퀀스 세그먼트는 입력 파일을 따라 그들의 연속 순위에 따라 목록으로 사용자가 사용할 수 있습니다. </li><li> 선택된 시퀀스에 대한 MRI 분석이 완료되면 사용자가 매개 변수 및 / 또는 입력 파일을 변경하여 동일한 웹 페이지에 새로운 프로세스를 시작할 수 있습니다. 예를 들어, 같은 MRI 매개 변수와 함께 이전에 생성한 임의의 샘플 # 1을 검토하기 위해, 사용자는 옵션을 분석하고 &quot;userfile_rand1_4&quot;파일을 선택하여 파일을 변경해야하고, 다시 분석 파일 버튼을 누르십시오. 새로운 파일 및 그래픽 디스플레이도 이전을 대체합니다. 각각의 &quot;세션 lable&quot;(GMRI 식별자)에서 결과와 모든 시험의 그림이 저장되고 마지막 활동에서 두 주 동안 사용할 수 있습니다. 결과 / 그림을 저장하기 위해ures 영구적으로, 사용자는 &quot;다운로드 파일&quot;탭 (맨 윗줄)을 선택하고 전체 세션이나 필요에 따라 개별 파일을 다운로드해야합니다. </li><li> 이 MRI 분석기 웹 페이지와 사용자가 공부할 수 <ul><li> (G + C) - 풍부하고 (A + T)이 풍부한 지역 </li><li> Purine (A + G) - 풍부하고 Pyrimidine (C + T)이 풍부한 지역 </li><li> 케토 (G + T) - 풍부하고 아미노산 (A + C)이 풍부한 지역 </li><li> - 풍부하고 A - 가난한 지역 </li><li> G - 풍부하고 G - 가난한 지역 </li><li> T - 풍부하고 T - 가난한 지역 </li><li> C - 풍부한 C - 가난한 지역 </li></ul></li><li> 게놈 MRI의 최신 릴리스는 Purine (R) / Pyrimidine 풍부한 지역을 연구하기위한 새로운 옵션이 있습니다 (Y) Z - DNA의 conformations을 형성 수도 교번 패턴. 현재이 옵션은 링크 &quot;Z - DNA &#39;에서 구할 수 있으며 다른 앞에서이야 기한 MRI 지역과 같은 기준으로 작동합니다. 사용자는 (히 + YR)의 번호에 대한 상위 및 하위 임계값을 선택합니다 스캔 윈도우에서 중복 dinucleotides. 이 프로그램은 비슷한 그래픽 출력과 purines과 pyrimidines를 교류하여 풍부한와 고갈 DNA 세그먼트의 파일을 생산하고 있습니다. putative Z - DNA 영역이 매우 (검토 F &amp; F 2011 참조) R / Y 기지를 교체하여 풍부하게해야합니다. </li></ol> 6. 게놈 MRI 패키지 (옵션) 내에서 추가 프로그램. 게놈 MRI 자원도 매우 구체적인 무작위 시퀀스의 생성을위한 두 가지 고급 옵션이 있습니다. 그들은 &quot;MRI 생성기&quot;와 맨 윗줄에서 &quot;CDS 생성기 &#39;탭을 통해 사용할 수 있습니다. <ol><li> MRI 생성기는 입력 파일과 동일한 oligonucleotide 구성 (SRI 발전기와 유사)와 무작위 시퀀스를 만듭니다. 그러나, 이외에, 무작위 시퀀스는 사용자가 지정한 특정 MRI 패턴을 모방. 이 웹 페이지 내에서 사용자가 목록 상자에서 했었하는 특정 MRI 패턴을 지정해야합니다. 목록 상자는 MRI 분석기 (예 : &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;)하여이 세션에서 검사하고 모든 패턴을 포함하고 있습니다. 이 옵션과 함께 생성되는 임의의 순서는 선택한 입력 파일과 동일한 oligonucleotide 조성과 &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;에서 볼 수로 및 가난 패턴도 같은 GC - 부자가됩니다. </li><li> CDS 발전기는 단백질 코딩 시퀀스의 랜덤에 사용됩니다. 이것은 사용자가 지정한 입력하여 코딩된 것과 같은 아미노산 서열을 유지합니다. 또한이 프로그램으로 사용자 입력 선택한 테이블에 지정된 동일한 코돈과 DI - 코돈의 편견을 유지합니다. CDS 발전기의 온라인 버전도 입력으로 단백질 순서를 허용합니다. 프로그램의 모든 다른 옵션은 기본 게놈 MRI 웹 페이지에서 다운로드할 수 있습니다 독립형 Perl 스크립트를 통해 제공됩니다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 프로토콜은 사용자가 뉴클레오 티드 시퀀스의 작곡 inhomogeneity을 공부하실 수 있습니다. 중요한 것은 또한 입력 시퀀스의를 approximating oligonucleotide 합성과 무작위 시퀀스의 다양한 생성을 지원합니다. , 보통, 복잡 eukaryotes의 게놈 시퀀스 구성에 단일 아니지만, 오히려 특정 세포핵의 농축 순서 세그먼트의 복잡한 모자이크 (예 : purine이 풍부한, (G + T) 풍부한, (A + T) 풍부한를 나타냅니다 등). 중형 규모 (30-1000 BP)에서 이러한 패턴 어퍼 블루 스파이크와 스파이크로 낮은 붉은 컨텐츠 가난한 세그먼트 (그림 1 및 2 참조)와 같은 콘텐츠가 풍부한 세그먼트를 선택한 보여주는 MRI 분석기의 그래픽 출력에 의해 시각입니다. 일반적으로 자연적인 순서 (그림 1)에 콘텐츠 풍부하고 컨텐츠 가난한 지역의 번호가 동일한 oligonucleotide를 가지고 해당 무작위 시퀀스에있는 지역의 동일한 유형 (그림 2)의 개수 이상 시대의 순서에 작곡. 염기 조성에 중형 inhomogeneity 이러한 시퀀스 세그먼트는 사용자에게 관심이있을 것으로 생각됩니다. 그들은 자세한 조사를 위해 게놈 MRI 출력 파일에서 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 단계 5.7에서 MRI 분석기 그래픽 출력 예입니다. 결과는 44 introns 인간의 샘플을 획득하였습니다. 블루 바는 이러한 introns 함께 GC 풍부한 영역의 위치를​​ 나타냅니다. 레드 바 GC - 가난한 (또는 AT - 풍부한) MRI 영역을 나타냅니다. y 축은 주어진 콘텐츠 유형에 대한 상위 및 하위 임계값을 포함하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="그림 2" /> 임의의 순서 &quot;userfile.rand1_4&quot;에 대한 그림 2. MRI 분석기 출력. graphiSRI 생성기 프로그램을 사용하여 무작위로 생성 순서 이내에 MRI의 칼 표현. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. MRI 분석기에서 텍스트 출력 파일의 시작 부분의 예제. 프로그램에 의해 감지 모든 콘텐츠 풍부한 및 콘텐츠 가난한 시퀀스는 마지막 (네번째) 열에 표시됩니다. 창문의 개수로 측정 그들의 상대적인 위치는, 첫 번째 열에 표시됩니다. 두 번째 및 세 번째 열이 각각 콘텐츠 풍부하고 컨텐츠 - 가난한 지역에 대한 지표입니다.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

중형 비늘에서 inhomogeneous 염기 조성 (30-1000 세포핵)와 지역별 복잡한 eukaryotes의 genomes에 과잉의하고 (intergenic 지역 introns, exons의 번역되지 않은 지역, 반복 요소) 어디서나 찾을 수 있습니다. 이 지역은 자주 비정상적인 DNA의 conformations와 관련된 있습니다. 예를 들어, purine-/pyrimidine-rich 시퀀스가​​ DNA의 triplexes (H - DNA)를 형성하는 경향이; purine / pyrimidine 기지를 교대로 순서는 Z - DNA의 conformations와 관련된, (G + C) - 풍부한 지역에 구조적 이상을 전시 B - 등 (Fedorov &amp; Fedorova 2010 년까지 검토) -, DNA와 백본 절단하는 경향이 될 수 요소 긴장을 풀기 DNA (A + T)이 풍부한 지역은 비정상적인 구조를 형성 수도 있습니다. 이러한 미드 레인지 패턴의 일부 (예 : (G + T)이 풍부한 지역) 기뻐서 조사하지 않고 여전히 철저한 탐구와 인식을 기다리고 있습니다. 우리의 게놈 MRI 웹 리소스의 주요 목표는 더 실험적인 분석을위한 그들의 가능한 기능의 탐험에 대해 이러한 MRI 영역의 식별에 사용자를 돕는 것입니다. MRI 지역의 지식에 통합과 유전자 예측 프로그램의 새로운 세대 (셰퍼드 2010) 향상과 게놈 기능과 특성에 대한 우리의 이해를 미리 수 있습니다.

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

비 코딩 intergenic 지역 introns, 그리고 exons의 번역되지 않은 세그먼트를 포함하여 복잡한 eukaryotes,의 게놈 영역 것은 깊이가 아닌 임의의 자신의 염기 조성에 및 시퀀스 패턴의 복잡한 모자이크로 이루어져 있습니다. 시퀀스 (예 : (G + T) - 풍부하고 purine이 풍부한 등 기지의 특정 기본 또는 조합하여 풍부한 아르 길이 30-10000 세포핵 - 이러한 패턴은 소위 미드 레인지 Inhomogeneity (MRI) 지역을 포함 ). MRI 지역은 종종 유전자 발현, 재조합 및 기타 유전 프로세스 (Fedorova &amp; Fedorov 2010)의 규제에 관련된 비정상적인 (비 - B - 양식) DNA 구조와 관련된 있습니다. 자신의 순서 inhomogeneity는 또한 이러한 게놈 시퀀스의 기능과 중요성 (프라카쉬 외. 2009) 지원 감소하는 경향이 돌연변이에 대한 MRI 지역 내에서 강력한 고정 바이어스의 존재. 우리가 자유롭게 사용할 인터넷 자원을 증명 - 게놈 MRI 프로그램 패키지 - (. 벡텔 외를 2008) 그들 내에서 다양한 MRI 패턴을 발견하고 특성화하기 위해 게놈 시퀀스의 전산 분석을 위해 설계합니다. 이 패키지는 또한 천연 입력 DNA 시퀀스에 다양한 특성과 대응의 수준 무작위 시퀀스의 생성을 허용합니다. 이 리소스의 주요 목표는 여전히 기뻐서 조사하지 않고 철저한 탐구와 인식을 기다리고 아르 비 코딩 DNA의 광대한 지역의 시험을 촉진하는 것입니다.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

우리는 게놈 시퀀스의 분석을 위해 공용 전산 웹 사이트를 제시한다. 그것은 여러 가지가 아닌 임의의 염기 조성과 함께 DNA 시퀀스 패턴을 감지합니다. 이 리소스는 복잡 다양한 수준 무작위 시퀀스를 생성합니다.

게놈 MRI - 게놈 DNA 시퀀스 내의 패턴을 학습에 대한 공개 자료

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K 조회수.  University of Toledo Health Science Campus. 우리는 게놈 시퀀스의 분석을 위해 공용 전산 웹 사이트를 제시한다. 그것은 여러 가지가 아닌 임의의 염기 조성과 함께 DNA 시퀀스 패턴을 감지합니다. 이 리소스는 복잡 다양한 수준 무작위 시퀀스를 생성합니다.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

연구

생물학

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Picoeukaryote의 게놈 변환<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

플라즈마 단백질 보존을위한 혈액 수집 장비로부터 게놈 DNA를 추출하는 실제적이고 새로운 방법

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...