이 작품은 부여를 통해 웰컴 트러스트에 의해 투자되었다 APM [076566/Z/05/Z] JCK [074318]와 인간 유전학에 대한 웰컴 트러스트 센터의 핵심 수상 [075491/Z/04].

1) 세포 배양 <ol><li> 관심있는 유전자를 표현 셀 유형을 선택합니다. </li><li> 두 DNA 위험 변종과 관심의 유전자 (그림 1) 이내 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 세포 라인을 선택합니다. </li><li> 문화 공급자의 사양에 각각 DNA와 RNA 추출 2 X 10cm 배양 접시를 준비 따라 선택한 셀 라인. </li><li> 세포는 80 % 합류는 아래에 설명된 절차를 수행하거나 상용 키트를 사용하거나 수확 세포에 대한 절차를 시작하고 DNA와 RNA를 분리 도달했을 때. </li></ol> 2) DNA 추출 <ol><li> 접시에서 미디어를 제거, PBS로 세척하고 용해 용액 (0.6 % SDS, 100 MM NaCl, 50 MM 트리스, 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 50 μg / ML RNase A)의 접시 500 μL에 추가할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 부드럽게 접시를 록. </li><li> ° C 야간 37 microcentrifuge 관과 부화에 세포 lysate을 다쳤어요. </li><li> 100 μg / ML의 최종 농도 proteinase K를 추가하고 37 ° C 하룻밤에 품어. </li><li> 페놀 - 클로로포름 산도 8, 반복의 동일한 볼륨으로 DNA를 추출 후, 클로로포름 / isoamyl 알콜의 동일한 볼륨 압축을 풉니다. </li><li> 10분의 1 일 제 3 M NaCl 및 100 % 에탄올 2.5 볼륨으로 DNA를 침전. </li><li> 4 30 분 13,000 rpm으로 회전 후 5 분 얼음에두고 ° C. </li><li> 70 % 에탄올로 DNA를 와시, 공기 건조하고 TE 200 μL에 resuspend 수 있습니다. </li><li> 65 품어 ° C 후 10 분 및 실온에서 2 일간 휴가. </li><li> 4 스토어에서 -20 ° C 또는 장기 ° C. </li></ol> 3) RNA 추출 <ol><li> 접시에서 미디어를 제거, PBS로 씻어 상온에서 10 분 TRIzol과 부화 1 ML를 추가합니다. </li><li> 스크 레이프 세포는 microcentrifuge 관에 몇 번, 전송 피펫 5 분 알을 품다. </li><li> 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는를 전송하고 클로로포름 200 μL를 추가합니다. </li><li> 흔들 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송하고 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 1 또는 2 (볼륨에 따라 다름) 최대 속도 30 초에 대한 RNeasy 컬럼과 스핀에 대한 솔루션을로드합니다. </li><li> 여기에서 RNeasy 키트 (Qiagen)의 지침을 따르십시오. </li></ol> 4) 핵산 샘플 준비 <ol><li> NanoDrop 분광 (써모 과학)을 사용하여 DNA와 RNA의 농도를 정량. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 임의의 decamers과 어깨 III 거꾸로 Transcriptase (Invitrogen)를 사용하는 RNA의 cDNA 500-1000 NG에서 준비합니다. </li></ol> 5) PCR 및 프리머 확장 분석 <ol><li> 각각의 DNA 마커에 대한 PCR의 primers, 한 게놈 DNA의 증폭을위한 쌍 및 cDNA 증폭에 대한 다른 쌍 (그림 2)의 디자인 이쌍합니다. 앞으로 장소와 게놈 오염을 피하기 위해 다른 exons의 cDNA 증폭을위한 프라이머를 역방향. 100-500 BP의 길이의 범위에 PCR 제품을 얻기 위해 디자인 입문서. </li><li> 0.5 U Immolase DNA 형성 촉매 (Bioline) 0.8 MM의 dNTPs, 2 MM MgCl 2, 0.2 M 각각의 프라이머와 cDNA 또는 DNA 중 20 NG 포함하여 10 μL PCR 반응을 준비합니다. 네 독립 반응의 각 샘플을 확대. </li><li> 증폭의 선형 사이클 단계에 번호를 유지 각 프라이머 쌍을위한 최적의 조건에서 PCR 반응을 실행합니다. </li><li> exonuclease와 PCR 제품을 잠복기로 여분의 PCR 프라이머 및 dNTPs를 제거 I 및 37 새우 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SAP) · 20 분 C. </li><li> 384 잘 접시에 두 번 각 PCR 제품을 스팟, 8 측정 각 샘플에 대해 사용할 수 있도록. </li><li> 같은 뇌관은 게놈과 cDNA PCR 두 제품에 사용할 수 있도록 분석 설계 (Sequenom) 소프트웨어와 확장 뇌관을 디자인합니다. 3ddNTPs의 조합 (그림 2)을 포함하여 14-18 BP 및 확장 믹스의 범위에서 뇌관의 길이를 지정합니다. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 MassARRAY 시스템 (Sequenom)를 사용하여 뇌관 확장 반응과 MALDI-TOF/MS 분석을 수행합니다. </li><li> 전형적인 프라이머 확장 반응 94에 시작하는 단계 ° C 2 분, 5 초, 52도 ° C 5 S와 72는 ° C를위한 94 ° C의 40주기에 의해 다음 5 S. 위해 포함 </li><li> 프라이머 확장 제품은 SpectroCLEAN 수지로 청소하고 SpectroPOINT nanolitre 자동 지급기에서 microarray (칩)에 전송됩니다. </li><li> 확장 oligonucleotides는 SpectroREADER 질량 분석기를 사용하여 든 - TOF에 의해 계량입니다. </li></ol> 6) 통계 분석 <ol><li> 실험의 일반적인 품질 MassARRAY의 Typer 소프트웨어 MALDI-TOF/MS 결과를 확인합니다. </li><li> 정상 영역 데이터를 포함하는 Allelotyping 보고서를 추출합니다. </li><li> 각 스펙트럼은을 계산을 위해allele 1 allele 2 (최대 면적 비율)의 피크 영역 사이의 비율. </li><li> 각 cDNA 샘플의 경우 8 측정에 걸쳐, Excel에서 해당 함수를 사용, 최대 면적 비율 의미 및 표준 편차를 도출. </li><li> 게놈 DNA를 8 측정에서 동일한 의미 피크 면적 비율을 도출. </li><li> 예상 1시 1분 비율에 편차를 평가하기 위해 게놈 의미의 비율에 의해 cDNA 의미 비율을 나누십시오. </li></ol> 7) 실험 컨트롤 <ol><li> 실험 유물을 배제하기 위해 적어도 세 번 실험을 반복합니다. </li><li> 추가 DNA 마커에 대해 가능하다면, 디자인 assays. </li><li> 순방향 및 역방향 모두 가닥을 어닐링 여러 PCR 프라이머 쌍 및 확장 primers을 디자인합니다. </li><li> 때마다 DNA 마커에 대한 heterozygous 있지만 표현형과 관련된 DNA 위험 변종 다니지 말고 부정적인 제어 세포 라인을 최대한 시험 (그림 1과 그림 3.) </li></ol> 8) 대표 결과 allele 특정 표현 분석의 예제는 질량 분석계의 흔적을 예제와 함께 그림 3에 표시됩니다. 그림은 4 가지 템플릿에서 실시 4 allele 특정 뇌관 확장 제품의 분석 결과를 보여줍니다. 상단 그래프 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 모두 두 가지 세포 라인의 게놈 DNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 단, 셀 라인은 위험 유전자 변형 (그림 1) heterozygous입니다. 하단 그래프는 동일한 세포 라인에서 생성된 cDNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 실험 유물의 결과로 첫 번째 정상은 항상도 게놈 분석에서 두 번째로 정상보다 높은 것입니다. 따라서 게놈 분석의 결과는 cDNA 데이터를 정상화하는 데 사용됩니다. 정규화 후, allele 비율이 세포 라인 1에서 크게 다른 (두 번째 정상가 다른 스펙트럼에 비해 낮은 나타나는 위치) 데이터를 그 세포 라인을 제안 B. 그것이 세포 라인에 1 매우 가까운 동안 운반 분석에서 유전자의 표현을 줄여 두 번째 정상에 의해 측정 allele와 단계에서 DNA의 변형. 셀 라인 B는 매우 편리한 부정적인 제어를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 세포주 선택 전략. 셀 라인은 A와 B는 오직 세포 라인은 위험 유전자 변형 (동그라미)에 대한 heterozygous입니다 베꼈는데 코딩 마커 (삼각형)에 대한 heterozygous 있습니다. 위험 변종의 푸른 allele은 전사의 낮은 수준 (실제 작동 변종에 가까운 상관 관계에 직접적인 영향이나하기 때문에)를 연결됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Allele 특정 뇌관 연장 분석.이 그림은 cDNA (왼쪽)와 게놈 DNA (오른쪽) 템플릿 모두에 대해 수행 실험 절차의 업무 흐름을 보여줍니다. PCR primers (회색 사각형)를 heterozygous 코딩 다형성 (삼각형)를 증폭하도록 설계되었습니다. 게놈 오염 PCR primers가 증폭이 cDNA 템플릿에서 수행됩니다 다른 exons (하늘색 막대)에 배치 순서를 어닐링 피하기 위해. PCR 제품은 다음 다형성에 다음 기지 어닐링, 확장 프라이머와 함께 진행 프라이머 확장 반응에 대한 템플릿으로 사용되고, 세 dideoxynucleotide의 적절한 믹스 (ddNTPs)는 터미네이터 (광장) 한 deoxynucleotide (동그라미)가 확장 각각 하나 또는 두 개의 기초의 기본 이지요. 그 결과 프라이머 확장 제품 든 - TOF 질량 분광법에 의해 분리 및 부량 수 있도록 다양한 대중 있습니다. DNA 마커의 푸른 allele에 해당하는 제품의 수량은 붉은 allele 상대적으로 낮습니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. allele 특정 표현 분석의 결과. 그림은 게놈 DNA를 수행 분석에서 질량 분석계 결과 및 세포주의 cDNA를 표시하고 셀 라인 B (그림 1).

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	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 사본 수준의 생체내 allele 특정 차이 평가에 의해 유전자 발현에 질병 관련 유전자 변종의 효과의 평가를 수 있습니다. 이 프로토콜의 상대적인 대본 풍부한이 든 - TOF하지만 같은 TaqMan 6,7와 같은 allele 특정 부량을 수 있도록 다른 기술에 의해 측정, 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한은 베꼈는데 코딩 마커의 가용성이다. 원칙에 따라 방법은 여기에 설명된하지만, polymorphisms 다른 클래스의 활용, 설명되었습니다. haploChip 분석은 transcriptional 시작하거나 II 8 효소를 RNA 특정 항체와 격리 염색질 immunoprecipitated 자료에있는 것입니다 유전자의 최종 사이트의 1킬로바이트 내에 위치한 마커를 사용하여 allele 특정 표현을 측정합니다. 템플릿 RNA 9 헤테로핵 때 또는 intronic SNPs를 사용할 수 있습니다. 특정 프로토콜은 haploChip 분석과 함께, 여기에 설명된 dyslexia에 대한 후보 유전자 (또는 읽기 장애)를 식별하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 처음에는 유전자 협회 연구 dyslexia 세 유전자 10 스패닝되었습니다과 관련된 DNA 순서 확인. allele 특정 유전자 발현 분석은 dyslexia - 관련 DNA 변종 표현 변동의 존재에 세 유전자 중 하나만에 대한 관찰하지만 다른 두 11 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCLEAN resin</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td><td>Sequenom</td><td></td><td>Varies according to assay design</td></tr><tr><td>MassEXTEND thermosequenase </td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chilled microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroREADER mass spectrometer</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

일반 복잡한 특징과 중요한 유전자 협회의 수가 지속적으로 증가하고있다. 그러나 이러한 단체의 대부분은 분자 수준에서 이해되지 않았습니다. phenotypes에 DNA 변종의 효과를 중재하는 메커니즘 중 하나는 복잡한 특성 1 특히 관련성이 높은 것으로 표시되었습니다 유전자 표현입니다. 이 방법의 휴대폰 컨텍스트 유전자 발현에서 특정의 DNA 시퀀스의 효과를 테스트합니다. 원리는 질병 (위험 변종) 2,3과 관련된 DNA 시퀀스 중 하나 사본을 가지고 세포를 분석, 유전자의 두 대립 유전자에서 발생하는 성적의 상대적 풍부한을 측정하는 것입니다. 따라서,이 방법에 사용되는 전지는 두 근본적인 genotypic 요구 사항을 충족해야합니다 그들은 DNA의 위험 변종에 대한 그들의 염색체 기원 (그림 1)에 따라 기록을 구별할 수있는 DNA 마커, 일반적으로 코딩 polymorphisms, 모두를위한 heterozygous해야합니다. DNA 위험 변종과 DNA 마커는 동일한 allele 주파수를 필요 아니지만 유전자 마커의 단계 (haplotypic) 관계를 이해해야합니다. 관심있는 유전자를 표현하는 세포 유형을 선택하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜은 섬유아 세포에서 핵산을 추출 채택 절차를 구체적으로 참조되지만 이러한 방법은 기본 세포 등 다른 세포 유형에 동일하게 적용됩니다. DNA와 RNA가 선택한 셀 라인에서 추출하고 cDNA가 생성됩니다. DNA와 cDNA는 코딩 DNA 마커 사를 대상으로 설계된 프라이머 확장 분석과 함께 분석하고 있습니다. 뇌관 연장 분석은 제조 업체의 사양에 따라 MassARRAY (Sequenom) 5 플랫폼을 사용 수행됩니다. 프라이머 확장 제품은 다음 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 질량 분석계 (MALDI-TOF/MS) 비행의 이온화 시간에 따라 분석됩니다. 선택 마커가 heterozygous 있기 때문에 그들은 MS의 프로필에 두 개의 봉우리를 생성합니다. 각 피크의 면적은 사본의 풍요에 비례하고 all​​elic 비율 (allele 1 : allele 2) 생성하는 MassARRAY의 Typer 소프트웨어의 기능을 측정할 수 계산합니다. cDNA에 대한 획득 allelic 비율은 allelic 비율이 1시 1분 기술 아티팩트에 대한 올바른 될 예정입니다 게놈 DNA에서 측정되는을 사용하여 표준입니다. 1 크게 다른 표준 allelic 비율로 표식은 표현형와 관련된 유전자 변종은 유전자 발현에 영향을 미칠 것을 제안, 동일한 셀에 두 개의 염색체에서 발생하는 성적 증명서의 양이 다르다는 것을 나타냅니다. 실험 컨트롤이 결과를 확인하는 데 사용해야합니다.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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22.8K 조회수.  University of Oxford. 유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

연구

유전학

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Thromboxane A2 수용 체 유전자의 C924T 다형성을 공부 하는 방법

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. While this has led to increased identification of likely pathogenic mutations associated with genetic syndromes, it has also dramatically increased the number of incidentally found genetic variants of unknown significance (VUS). Determining the clinical significance of these variants is a major challenge for both scientists and clinicians. An approach to assist in determining the likelihood of pathogenicity is signal-to-noise analysis at the protein sequence level. This protocol describes a method for amino acid-level signal-to-noise analysis that leverages variant frequency at each amino acid position of the protein with known protein topology to identify areas of the primary sequence with elevated likelihood of pathologic variation (relative to population &#34;background&#34; variation). This method can identify amino acid residue location &#34;hotspots&#34; of high pathologic signal, which can be used to refine the diagnostic weight of VUSs such as those identified by next generation genetic testing.

Amino acid-level signal-to-noise analysis determines the prevalence of genetic variation at a given amino acid position normalized to background genetic variation of a given population. This allows for identification of variant &#34;hotspots&#34; within a protein sequence (signal) that rises above the frequency of rare variants found in a population (noise).

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

암 연구학

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

의학

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect and quantify hundreds of thousands of metabolite features. However, the application of these techniques to a large number of samples is subject to more complex interactions, particularly for genome-wide association studies (GWAS). This protocol describes an optimized metabolic workflow, which combines an efficient and fast sample preparation with the analysis of a large number of samples for legume crop species. This slightly modified extraction method was initially developed for the analysis of plant and animal tissues and is based on extraction in methyl tert-butyl ether: methanol solvent to allow the capture of polar and lipid metabolites. In addition, we provide a step-by-step guide for reducing analytical variations, which are essential for the high-throughput evaluation of metabolic variance in GWAS.

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In this protocol, we present an optimized workflow, which combines an efficient and fast sample preparation of many samples. In addition, we provide a step-by-step guide to reduce analytical variations for high-throughput evaluation of metabolic GWAS studies.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

생화학

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

생물학

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.