Name: feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
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참고 : 무균 문화 조건을 유지하기 위해서는이 프로토콜의 절차를 모두 무균 실험실 방법을 사용하여 수행하고 층류 후드 아래에 실시하고 있습니다. 시작하기 전에, 모든 미디어는 37 equilibrated되도록 ° C 적절하게 기름. Geltrex - 코팅 문화 요리를 준비 참고 : CELLstart 코팅 문화 요리의 사용을 위해 부록을 참조하십시오 <ol><li> 해동 한 천천히 2-8에서 Geltrex (1 ML) ° C의 튜브 및 넉아웃 D-MEM/F-12 99 ML에 1:100 그것을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다. 참고 : 일부 IPS 세포 라인은 최적의 성장을 위해 다른 Geltrex 희석이 필요할 수 있습니다. 대체 dilutions에 대한 부록을 참조하십시오. </li><li> Geltrex 솔루션 (35 - mm 요리 1 ML, 60 mm 요리 1.5 ML) 각 문화 요리의 전체 표면을 커버. </li><li> 건조를 방지하고 37에서 1 시간 동안 요리를 부화 Parafilm 각 접시 ° C. 봉쇄해 참고 : 최대 1 개월이 지점에서 4 ° C에서 Geltrex - 코팅 문화 요리를 저장할 수 있습니다. 밖으로 건조에서 Geltrex을 방지하기 위해 Parafilm 각 요리를 밀봉합니다. </li><li> 이전 사용하기 층류 후드에 Geltrex - 코팅 요리를 전송하고는 실온 (약 1 시간)에 평형 수 있습니다. </li></ol> 완료 녹아웃의 SR 공급기 - 무료 매체를 준비 <ol><li> 10 μg / ML 기본 FGF 솔루션 1 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장 최대 6 개월까지. <table border="0"><tbody><tr><td> 기본 FGF </td><td> 10 μg </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990 μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : BSA는 같은 농도에서 HSA 또는 넉아웃의 SR로 대체 수 있습니다. </li><li> 2 MG / ML Dispase 솔루션의 50 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. 4 솔루션 및 저장 ° C 최대 2 주 동안을 소독 필터. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 MG </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 전체 녹아웃의 SR 피더 - 무료 (KSR - FF) 매체 무균 아래 표에 나와있는 구성 요소를 결합 100 ML를 준비합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 마네 DMEM/F12 (Cat. 번호. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (Cat. 번호 35050-061) </td><td> 200 MM </td><td> 2 MM </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR (Cat. 번호. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR - GFC (Cat. 번호. A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. 번호. PHG0024) </td><td> 10 μg / ML </td><td> 20 NG / ML </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> 최대 일주일을 위해 당신은 2-8 ° C에서 KSR - FF 매체를 저장할 수 있습니다. </li><li> 온도와 가스의 전체 매체를 미리 equilibrating 바로 전에 무균 0.1 MM 최종 농도 2 메르 캅 토 에탄올의 필요한 볼륨 (55 MM 주식 농도)을 추가합니다. 예를 들어, KSR - FF 매체의 100 ML를 준비하는 것은 2 - 메르 캅 토 에탄올 (1:550 희석) 또는 55 mm의 182 μL를 추가, 2 - 메르 캅 토 에탄올이에 대한 1X 완료 매체에 추가 2-8 ° C에서 저장될 수 있습니다 최대 일주일. </li></ol> KSR - FF 중간에 iPSCs를 적응 <ol><li> 시작하기 전에, 후드에서 상온에 Geltrex 코팅 요리를 미리 평형. </li><li> 문화 MEF 피더 세포에서 iPSCs 그들은 70-80%의 합류 때까지. MEF 기반 문화 프로토콜에 대한 GIBCO 마우스 배아의 Fibroblast 수첩을 참조하십시오. </리&gt; <li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 문화 요리에서 매체를 기음과 Dispase 솔루션의 적절한 금액을 추가합니다. 3~5분에 대해 37 ° C에서 요리를 품다. </li><li> 각 문화 선박에서 Dispase 솔루션을 기음과 D - PBS (2 3 회)로 부드럽게 MEF의 피더 세포를 씻어. </li><li> 각 문화 선박을 완료 마네의 SR 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 부드럽게 문화 선박의 표면에서 세포를 긁어 셀 스크레이퍼 또는 5 ML의 피펫을 사용합니다. 참고 : 하드 IP를 적응 세포 라인에 대한 대체 적응 프로토콜에 대한 부록을 참조하십시오, </li><li> 별도의 15 ML 원뿔 튜브에 각 문화 접시에서 세포 현탁액를 수집합니다. 전체 녹아웃의 SR 매체의 적절한 금액을 각 문화 선박 린스, 그리고 D - PBS는 세포 현탁액을 포함 15 ML 원뿔 튜브로 매체를 씻어 추가합니다. 하나의 세포로 세포 대단히 짧은 시간을 휴식하지 않는주의 </li><li> 펠렛 iPSCs 5 분 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. </li><li> iPSC 펠렛에서 뜨는을 대기음. 분할 비율 (표 1)에 따라 KSR - FF 매체의 적절한 금액 펠렛을 Resuspend. 작은 대단히 짧은 시간이 표면에 잘 부착하지 않기 때문에, 작은 크기로 휴대 대단히 짧은 시간을 아프게하지 마십시오. 참고 : iPSCs이 KSR - FF 매체에 iPSC MEF 문화 미디엄에서 직접 passaged 후에 우리는 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율을 권장합니다. 일반적으로 1시 3분과 1시 5분 사이의 분할 비율이 적합하지만, 1시 2분에서 passaging 것은 피더 무료 문화에 적응 할 때 필요한 세포의 높은 밀도를 보장합니다. </li><li> 이전 Geltrex 코팅 요리 iPSCs을 도금하는 사전 코팅 접시에서 잔여 Geltrex 솔루션을 기음, 천천히 각 문화 요리에 세포 현탁액의 적절한 금액을 추가합니다. 참고 : 도금하기 전에 요리를 씻어하지 않습니다. </li><li> 접시의 표면에 걸쳐 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리를 이동합니다. 부드럽게 공기 4-6%의 CO 2의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. KSR - FF로 보낸 매체 매일 교체합니다. </li></ol> KSR - FF을 사용하여 Passaging 인간의 IPS 세포 <ol start="13"><li> 세포 70-80% 합류하고 subcultured 준비가되었는지 확인하기 위해 현미경으로 전체 KSR - FF의 성장 인간 iPSCs을 준수. 1 그림을 참조하십시오. 참고 : 식민지가 너무 밀도 또는 너무 커질 경우, 증가 차별이 발생합니다. </li><li> 잘라와 문화를 passaging하기 전에 어떠한 차별 iPSC 식민지를 제거합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 선박에서 보낸 매체를 대기음하고, D - PBS로 두 번 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 문화 선박 (예, 60 mm 문화 요리 당 Dispase 솔루션 1 ML)로 사전 예열 Dispase 솔루션을 추가합니다. 코트 전체 세포 표면에 소용돌이 문화 우주선합니다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 문화 함선을 품어. </li><li> 인큐베이터에서 혈관을 제거 Dispase 솔루션을 기음, 부드럽게 D - PBS로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 세포 스크레이퍼를 사용하여 문화 접시의 표면에서 세포를 긁어 및 살균 15mL 원심 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 부드럽게 분리하지 않은 세포를 &quot;해제 분사.&quot;, KSR - FF로 두 번 문화 접시를 씻어 수영장은 15mL 튜브에 세포와 매체를 씻어. </li><li> 상온에서 펠릿 세포 5 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 대기음하고 폐기. </li><li> 부드럽게 튜브가 완전히 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 이동시키다을 버려. </li><li> 부드럽게 5mL serological 피펫을 사용하여 사전 equilibrated KSR - FF의 세포를 resuspend. 씹다하지 마십시오. 참고 : 부드럽게 손상을 방지하기 위해 무력을 사용하지 않고 세포를 resuspend하는 단계에서 중요한 그것입니다. </li><li> 원하는 분할 비율에 신선한 60 mm Geltrex - 코팅 접시에 세포를 전송하고 표면을 가로질러 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리 이동합니다. </li><li> 의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 플레이스4~6%는 공중에 2 CO. </li><li> 그 다음날, 부드럽게 세포 파편을 제거하는 KSR - FF로 보낸 매체를 대체합니다. 이후 매일 지출 매체를 교체합니다. IPS 세포는 매일 그들로 (약 매 4~5일) 필요한 통로 관찰. Passaging은 세포가 70~80%의 합류에 도달했을 때 권장합니다. IPS 세포 cryopreservation 융해 들어, &quot;완료 마네 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Cryopreserving 인적 IPS 세포 복구하기&quot;라는 제목의 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 예상 결과 <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 아래의 위상 콘트라스트 이미지는 완전 넉아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Geltrex - 코팅 문화 요리에 성장 iPSCs를 보여줍니다. iPSCs 큰 핵 및 세포질 부족한 특징 hESCs에 형태학 유사한 나타냅니다. (40x 확대) <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 35mm 디시 </td><td> 60mm 디시 </td><td> 100mm 디시 </td></tr><tr valign="top"><td> 완료 녹아웃 SR 미디어 </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex 솔루션 </td><td> 1 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 4-5 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 3-4 ML </td></tr><tr valign="top"><td> rinsing을위한 D - PBS </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. 추천 볼륨 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">부록을 참조하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

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<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. no. 12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>Cat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. no. 17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium </td><td></td><td>Cat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

인간과 마우스 섬유아 세포가 배아 줄기 세포에 상당히 유사 자질을 가진 1-3 IPS 세포를 생성하는 재설정 될 수 있다고 2006 년에 발견은 약물 발견, 세포 치료와 기초 연구를위한 pluripotent 세포의 중요한 새로운 소스를 만들었습니다. GIBCO 미디어 및 시약 년 동안 pluripotent 줄기 세포 연구의 선두에있다. DMEM가 마네 세럼 교체와 보충 마네는 배아 줄기 세포의 성장과 지금은 IPS 세포 배양 3-9위한 최고의 매체입니다. 이 황금 표준 미디어 시스템은 이제 마네의 SR 성장 팩터 칵테일의 추가와 함께 피더 무료 문화 사용할 수 있습니다. 전통적인 인간의 ES와 IPS의 세포 배양 방법은 마우 스나 인간 fibroblast 피더 레이어의 사용 또는 피더 - 에어컨 매체를 필요로합니다. 이러한 문화 방법은 규모에 노동 집약, 하드 있으며, 그것은 정의되지 않은 상황으로 인해 undifferentiated 허리의 세포를 유지하기 어렵습니다. Invitrogen은 여전히​​ 마네의 SR의 사용을 유지하면서 당신이 피더 - 무료로 전환 엉덩이 셀 문화를 쉽게하도록 마네의 SR 성장 팩터 칵테일을 개발했습니다.

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Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

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Research

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비디오: Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

연구

발생학

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

신경과학

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS and hES cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

This protocol describes the detailed procedure for cryopreserving human iPS cells in KnockOut SR cryopreservation medium and recovering these cells in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium or feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

생물학

자동 배양 시스템을 사용한 유도 만능 줄기세포 분화

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

저자 스포트라이트: 재현성 향상을 위한 iPSC 문화 자동화 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

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