저자는 촬영에 도움을 음성 녹음, 그림에 대한 M. Borczyk, 바이러스 생산을위한 A. Trąbczyńska, 유전자형에 대한 M. Ziókowska 및 A. Mirgos에 대한 M. Steczkowski에게 감사의 말씀을 전합니다. KR은 K. Deisseroth에서 CaMK 프로모터의 제어하에 형광 단백질 mCherry을 표현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 종류 선물을 인정합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에 의해 재정 CEPT ​​인프라를 사용하여, 조직의 구조와 기능, 신경 생물학, 실험 생물학의 Nencki 연구소의 센터의 동물 모델 및 연구소의 실험실의 핵심 시설에서 수행 한 - 유럽 지역 개발 기금 내를 2,007에서 2,013 사이의 운영 프로그램 &quot;혁신 경제&quot;. 이 작품은 국립 과학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다 : 소나타 비스 2012 / 05 / E / NZ4 / 0299​​6, 하모니아 2013 / 08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013 / 08 / W / KR과 소나타 비스 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC에

아래에 설명 된 모든 실험 절차는 실험 생물학의 Nencki 연구소, 과학 폴란드어 아카데미에서 현지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 참고 : 관련 동영상의 장면 중 일부는 가속된다. 속도 계수는이 장면에 표시됩니다. 1. 수술 준비 <ol><li> 오토 클레이브에 액체와 면봉을위한 모든 도구, 유리 용기를 소독. 비용 소비 장갑을 사용합니다. 수술 테이블, 정위 프레임과 70 % 에탄올 모든 주변 지역을 청소합니다. 모든 살균 장비에 대한 멸균 공간을 만들기 위해 무균 수술 패드를 사용합니다. 작은 조각으로 gelfoam을 잘라 및 멸균 식염수를 흡수. 참고 : 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따르면, 에탄올 멸균이나 높은 수준의 소독제도 아니다. 그것은 단지 이전에 멸균 표면 세정 / 탈지 화제로서 사용되어야한다. </li><li> 일에 동물을 넣어전자 유도 챔버 / 분 2 L의 5 % 이소 플루 란 레벨 및 산소의 흐름을 설정한다. 이 절차는 약 3 분 정도 소요됩니다. </li><li> 유도 챔버에서 동물을 가져 가라. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다. </li><li> 정밀 트리머가 눈까지 (귀 사이) 머리의 뒤쪽에서 머리를 면도 사용. </li><li> 정위 프레임에 동물을 배치하고 귀 막대 머리를 안정. </li><li> 1.5 %의 이소 플루 란과 0.3 L / 분 산소 마취 수준을 설정합니다. </li><li> 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 각각, 염증, 통증 및 감염을 예방하기 Tolfedine (4 ㎎ / ㎏) Butomidor (2 밀리그램 / kg) 및 Baytril (5 ㎎ / ㎏)을 동물에 피하 주입한다. </li><li> 뇌 부종을 방지하기 위해 덱사메타손과 동물의 근육 (0.2 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 주 : 덱사메타손 피하 주사 또는 복강 내 근육의 손상을 방지 할 수있다. </li><li> (S)를 이용하여 피부를 닦아Betadine와 terile 면봉은 70 % 에탄올 하였다. </li><li> 장갑을 변경하고 70 % 에탄올로 스프레이. 참고 : 멸균 필드를 터치하지 않는 일회용 장갑을 사용하는 동안. 단지 무균 수술기구 및 멸균 면봉의 팁 동물을 터치합니다. </li></ol> 2. 두개골 창 외과 <ol><li> 집게로 피부를 들어 올려 마이크로 가위가 눈의 앞 지점에 비스듬히 다음 머리의 기본을 따라 수평으로 피부를 절개하고 사용. 피부 플랩을 제거합니다. </li><li> 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 골막에 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 적용합니다. </li><li> 골막을 제거하기 위해 멸균 면봉이나 메스를 사용합니다. 멸균 면봉와 두개골을 건조. </li><li> 멸균 된 바늘을 사용하여 그들을 고정하고 치과 용 시멘트와의 접촉을 방지하기 위해 피부의 가장자리에 밀도 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> t 이상 멸균 3mm의 커브 글라스를하다lambdoid 봉합에 전방 그는 두개골. RSC에서 커버 슬립을 중심 좌표 : AP, 브레 그마 -2.8; ML은 멸균 된 바늘로 두개골 표면을 긁어서 0 표 커버 슬립의 가장자리를 정수리. 70 % 에탄올로 멸균 용기에 다시 커브 글라스를 넣습니다. </li><li> 3mm 직경의 원형 윤곽을 소경으로 버어 고속 치과 드릴을 사용한다. 멸균 식염수에 담근 면봉와 뼈 먼지 드릴링 사이트를 청소합니다. 가끔 출혈을 중지하고 뼈를 청소 gelfoam을하고 면봉을 사용합니다. </li><li> 드릴링 사이에서 부드럽게 뼈 원을 터치하고 이동성을 확인하여 미세 집게로 뼈의 두께를 확인합니다. 뼈 봉합의 지역에 두꺼운 있음을 알아 두셔야합니다. 뼈 원 모바일이며 뼈의에도 얇은 층 주상에 남아있는 경우 드릴링 중지. 식염수 담근 면봉에 남아있는 모든 뼈 먼지의 작동 필드를 청소합니다. </li><li> 드릴 CIR을 포함, 시추 지역에 멸균 생리 식염수를 삭제CLE. 조심스럽게 부드럽게 한 다음 미세 집게와 함께 뼈 원을 올립니다 단단히 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 경질의 손상을 방지하기 위해 그것을 해제하는 동안 뼈 원을 왜곡하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 출혈을 멈추게하기 위해 경질에 멸균 생리 식염수에 담가 gelfoam을 적용 할 수 있습니다. 모든 출혈이 완전히 중지 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 응고 과정을 방해하지 gelfoam을 제거합니다. 참고 :이 시점에서 출혈이 깊은 것을 입증 할 수 있도록 봉합 영역이 매우 혈관이다. 출혈이 완전히 중지하는 것은 충분한 시간 동안 기다릴 필요하다. 얼음에 배치하여 냉각 식염수 젖은 gelfoam을 유지하는 것이 도움이된다. </li></ol> 3. 바이러스 감염 <ol><li> 정위 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결합니다. </li><li> 주사기에 35G 바늘을 삽입합니다. 그것을 소독 에탄올로 주사기 10 번 세척 및 멸균 식염수 10 회 전자의 흔적을 제거하는thanol. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다. 펌프에 주사기를 삽입합니다. 참고 : 다른 소독제를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> (10 ~ 12 PFU 권장) rAAV2 / 1 mCherry 준비의 단일 투여 량을 해동 얼음에 보관하십시오. 바이러스 솔루션과 주사기를 입력합니다. </li><li> 브레 그마에 바늘을 중앙에 다음 조심스럽게 다음 좌표를 사용하여 해마에 삽입 : AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. 이 좌표는 개두술의 가장자리 근처에 위치한다. 조직 안정화를 위해 5 분 동안 기다립니다. </li><li> 50 NL / 분의 속도로 rAAV2 / 1 mCherry 용액 0.7 μl를 주입한다. 바이러스가 완전히 흡착하는 10 분을 기다립니다. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생하는 경우 gelfoam을 함께시킨다. 반대측 사이트와 반복합니다. </li></ol> 4. 두개골 창 주입 <ol><li> 드릴 원 프레임의 경질의 상단에 살균, 건조 커브 글라스를 놓습니다. forc와 커브 글라스를 잡고분기 EPS 부드럽게 경질을 평평하고 커브 글라스을 가지고 &#39;두개골 표면에 가까운 가장자리. 참고 : 커브 글라스가 응고와 출혈이 다시 시작을 방해하는 것이 가능하다. 이런 경우, 커브 글라스를 올려 알코올, 건조에 배치 2.9 단계로 복귀. </li><li> 멸균 된 바늘이 커브 글라스 가장자리에 짙은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용 사용하면 두개골에 첨부합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> 두개골의 앞 부분에있는 고정 바 (M2 너트 또는 사용자 정의 만든 디자인)을 놓습니다. 바의 가장자리에 걸쳐 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. <ol><li> 세션 이미징 동안 두개골 윈도우의 수평 위치를 사용하는 위치에 고정 줄​​을 놓습니다. 창에서 가능한 한 멀리 떨어져 배치합니다. 이 윈도우에 너무 가깝게 배치되는 경우, 맞춤형 홀더를 연결 바 나사 촬상 과정 대물위한 걸림돌 포즈 것이다. </li></ol></li><l난&gt; 치과 아크릴을 준비하고 유리 주위의 두개골 표면에 적용됩니다. 이 창 주위 분화구 형상을 형성하는 것이 도움이된다. 그것은 물 목적으로 이미징 나중에 적용 물 공동을 생성합니다. </li><li> 두개골 창 주위의 분화구를 강화, 운영 영역, 피부 가장자리, 고정 줄​​의 나머지 부분을 덮고, 치과 아크릴과 모자를 만듭니다. 치과 시멘트가 경화 될 때까지 기다립니다. </li><li> 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수 챔버에 넣어. </li><li> 생리 기능을 관찰하면서 동물이 수술에서 회복까지 기다립니다. </li><li> 48 시간 동안 수술 후 진통제 (카프로 펜, 10 ㎎ / ㎏) 및 항생제 치료 (baytril, 5 ㎎ / ㎏)을 적용합니다. </li></ol> 5. 이미지 <ol><li> 전원을 현미경, 사파이어 레이저 : 티를 시작합니다. 이 실험에 사용 된 시스템은 두 개의 광자 레이저, OPO 시스템과 이중 하나로 이루어질의 PMT를 구비한다. </li><li> induc에서 동물을 넣어기 챔버 마취를 유도한다. </li><li> 현미경 가스 마취 마스크 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 0.3 L / 분의 산소 유량과 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 감소시킨다. </li><li> M2 나사 (또는 다른 사용자 정의 시스템)와 사용자 정의 현미경 프레임에 동물을 고정합니다. 두개골 창을 수준. 주 : 특정 맞춤 프레임 나은 결과 (개선 된 헤드 안정성 만성 실험 기간 동안 다수의 세션에서 일정한 위치)를 제공하지만 현미경 제조업체 헤드 고정 시스템을 사용하는 것이 가능하다. </li><li> retrosplenial 피질의 측면 중 하나에 위드 현미경 설정 및 낮은 배율 목표 중심 뷰를 사용하고, 커버 슬립의 표면에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 분화구 모양의 아크릴 우물에 물 방울을 적용합니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다. 물 메 니스 커스 콘 때까지 두개골 창으로 목표를 이동시편과 목표를 nects. </li><li> 두 광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 바닥에 시편 위로를 스캔 시작합니다. 뇌경막의 교차점 높은 비 특정 신호의 섬광으로 볼 수 있습니다. </li><li> 전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포에서의 신호 강도에 따라 두 채널 (GFP 및 mCherry)의 현미경 취득 설정을 조정한다. </li><li> (다른 세포로부터 분리 된 수지상 나무) 적절한 신경을 찾은 후 가장 낮은 줌과 5 미크론의 Z-거리 만 GFP의 filterset를 사용하여 초기 검사를 수행합니다. </li><li> 스캔 한 스택의 최대 투사를 구하여 (반전 색상을 사용하여) 주석을 위해 그것을 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 원하는 형태 세부 이미지에 수의 값으로 줌을 설정합니다. 이미지 기준으로 최대 투사를 사용하여 GFP 및 mCherry 채널의 전체 수지상 나무. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

저자 (KL, MR, KR)은 특허에 대한 권리를이 조에서 사용되는 홀더 프레임 (PL410001을) 보류가 있습니다.

현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 mCherry는 해마에 주?...

이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다. 표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 3 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈. 본 논문에서는 생체 현미경 (6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 (7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 (6)과 같은 행동의 범위에 포함했다. 신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 (9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 10 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drug</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>5-2% pre-operative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>1.5-2% during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexametasone</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td>Dexasone 2mg/ml</td>
			<td>0.2 mg/kg intramuscular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>5 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolfedine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4%</td>
			<td>4 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butomidor</td>
			<td>Richter Pharma</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>2 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>KRKA-Polska</td>
			<td>Rycarfa 50mg/ml</td>
			<td>10 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>Lignocainum</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>20 mg/g</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Spongostan dental; REF MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dedra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA glue</td>
			<td>Pelikan Daniel</td>
			<td>20G Huste</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>SpofaDental</td>
			<td>Duracryl Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>HSE-64-0720</td>
			<td>3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Sigmed</td>
			<td>Keystone KVet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation bar</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M2 or M3 screw nuts could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Renex</td>
			<td>PN-7B-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BM.183.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>KOZO</td>
			<td>XTL6445T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder frame</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Upright Axio Examiner Z1</td>
			<td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus</td>
			<td>gift from K. Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Thy1-GFP 기자 마우스에서 신경 세포의 일부에서 GFP의 발현은 대뇌 피질의 수상 돌기 및 RSC에서 지역 축삭 돌기의 생체 내 이미징에 있습니다. 그림 1a는 눈에 보이는 여러 GFP 양성 수상 돌기 이미지의 스택의 최대 투사를 보여줍니다. 세포체는 동맥에 의해 가려한다.도 1b는도 1a에 표시된 수지상 분기의 단일면 확대 이미지 (디지털 줌 3 배)를 ...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K 조회수.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

비디오: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

동시에 두 광자

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