설명이 프로젝트는 부여 번호 NIAID / NIH에서 P01 AI055637와 U54 AI057156 지원했다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 경찰과 프로그램 사무실, NIAID, 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1 일 : F. tularensis 플레이트 접종 <ol><li> F.의 플레이트 냉동 재고 문화 뮬러 - 힌턴 한천에 tularensis 2.5 % (권 / 권) 기증자 송아지 혈청, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 그리고 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨과 보충. F. 그로 ° C 5 % CO 2와 함께 약 24 H. 위해 37 tularensis </li></ol> 일 2 : F. tularensis 액체 미디어 접종 <ol><li> 양이온 - 조정 뮬러 - 힌턴 매체 (1.23 MM의 염화칼슘 이수화물 및 1.03 MM의 마그네슘 염화 hexahydrate을 포함) 1 리터 준비하고 압력솥. 37 냉각하면 ° C, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX 대한 추가 보완 매체. 이 500 ML의 aliquots로 (0.22 μ) 소독 매체를 필터링합니다. </li><li> 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 보충 뮬러 - 힌턴 매체 및 전송 12 ML를 제거합니다. </li><li> 멸균 10 μl 접종 루프를 사용하여, F.의 큰 loopful을 다쳤어요 뮬러 - 힌턴 중간 (단계 2 참조) 12 ML에 한천 플레이트 (1 일 이상) 및 전송 박테리아에서 tularensis 성장. 피펫 솔루션을 여러 번 대단히 짧은 시간을 헤어지게하고 동질적인 박테리아 정지를 준비합니다. 와동하지 마십시오. </li><li> 멸균 피펫을 사용하여 3 단계에서 세균 현탁액의 5 ML 각 500 ML 선박의 예방. 37 국물 문화를 성장 ° C 부드러운 흔들림 (뉴 브 런 즈윅 이노바 2300 시리즈 쉐이크에 190-200 RPM)를 14-18 H하십시오. </li></ol> 3 일 : Spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 농도 구배 원심 분리 <ol><li> F.를 구합니다 tularensis의 흔들림이 인큐베이터에서 문화는 각각의 광학 밀도를 확인 각 500 ML 문화 1 - ML 나누어지는를 제거합니다. F.를 사용할 때 우리는 최적의 멤브레인 추출 및 절연 결과를 발견 0.2 사이 0.4 (~ 10월 7일에서 10월 8일까지 CFU / ML)로 OD 600과 상호 성장의 초기 단계에 로그 tularensis 세포. 0.2 이상의 OD 600 적은 비용으로 문화는 이후 자당의 그라디언트에 대한 총 멤브레인 소재의 충분한 수량을 얻을 수 없습니다. 반대로, 0.4 (고정 단계를 근접)보다 OD 600 이상과 문화가 혼합 막 fusions를 얻을 것으로되었습니다. </li><li> 15 30 분 7,500 X g에서 문화를 원심 분리기 ° C는 세포를 수집합니다. 그것이 이후 펠렛 서스펜션을 용이하게하기 때문에 우리는, 넷 250 ML의 원심 분리기 병의 문화의 원심 분리하는 것이 좋습니다. </li><li> 조심스럽게 각 원심 분리기 병에서 미디어 표면에 뜨는를 제거하고 단단히 초과 성장 매체를 제거하는 흡착제에 병을 누릅니다. </li><li> 원심 분리의 10 분 이내에 다음과 같은 완성, 0.75 M의 자당 (5 MM 트리스, 산도 7.5의)의 8.75 ML 각 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다. 이들 네 박테리아 쥐똥이 일시 중지하고 10 분 이내에 살균 250 ML 플라스크 (작은 stirbar로)로 (세균성 정지 35 ML 총) 양도해야합니다. </li><li> 부드럽게 stirplate에 세포 현탁액을 혼합하는 동안, 천천히 10 분 과정 10여 MM 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML (2 볼륨) (5 MM 트리스, 산도 7.8)을 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 수준 아래 피펫의 끝에있는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. stirbar 철저하게 얼굴이 볼만 또는 버블 형성 원인만큼 빠른 세포 현탁액을 혼합 아니라 충분한 속도로 회전해야합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 추가되었습니다 후, 실온에서 30 분 솔루션을 품어. </li><li> 30 분 부화 후, 천천히 200 μg / ML의 최종 농도 2 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 11 ML (1 / 10 일 볼륨)을 추가합니다. 라이 소 자임 솔루션뿐만 동안 세포 현탁액을 섞어 계속합니다. 위에서 바와 같이, 라이 소 자임의 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 유체 수준 아래에 피펫 팁과 라이 소 자임 솔루션을 추가합니다. 주식 라이 소 자임 솔루션 (2 MG / ML) 단일 사용 aliquots에서 준비하고 3~4개월위한 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. </li><li> 30 분 동안 부화, 작은 stirbar 룸 온도 Cellgro 분자 학년 DH 2 O (4.5 권)의 530 ML과 멸균 1L 플라스크를 준비합니다. </li><li> Osmotically 부드러운 혼합과 10-15 분 과정을 통해 분자 학년 DH 2 O (7 단계에서)의 530 ML에 느린 희석 (약 11 ML / 분 유량)의 세포 현탁액을 (6 단계에서) lyse. 때문에이 단계에서 큰 솔루션 볼륨의 적절한 혼합을 보장하기 위해 stirbar 속도를 향상시킬 수 있습니다. stirbar 얼굴이 볼만 또는 버블 형성으로 이어질 정도로 빠르게하지 철저하게 세포 현탁액을 분산하기 위해 충분한 한번 DH 2 O에 추가 속도로 회전하지만해야합니다. 셀의 균일한 희석을 촉진하기 위하여, 피펫의 끝은 stirbar에 인접한 술병의 바닥에 휴식과 세포 현탁액을 추가내 현탁액. 우리는 25 - ML의 pipettes이 단계에서 가장 잘 작동 것으로 나타났습니다. 조심스럽게 희석 과정을 모니터하고 유속 세포, 세포 대단히 짧은 시간, 그리고 세포 가닥의 로컬 쌓일 해산하기 위해 필요를 방해. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. </li><li> 30 분 부화 후 10시 30 분 7500 XG 50 - ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 삼투 용해 용액 40 ML aliquots를 전송 ° C가 그대로 세포와 이물질을 제거합니다. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 1L 플라스크에 각 원뿔 관 및 수영장 supernatants에서 뜨는의 27-30 ML을 제거 </li><li> 4 2 H에 대한 200,000 X G (F50L - 8x39 FiberLite의 초원 심 분리기의 회전자에 44,400 RPM) ° C. 16 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기로, 각각 풀링 뜨는 25 ML을 전송 각 로​​터 8 튜브를 보유하고 있습니다,이 단계 두 로터 두 ultracentrifuges 필요하므로. 또한, 8 튜브의 두 번째 세트 centrifuged ° C까지 4에서 개최한다. </li><li> 초원 심 분리기 실행의 완성 10 분 이내에 멤브레인 resuspension 버퍼를 수정할 준비를합니다. 멸균 튜브에 막 중지 버퍼 8 ML (25 % [WT / WT] 자당, 5 MM 트리스, 30 MM MgCl 2) 전송 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제 칵테일과 Benzonase의 375 U 1 타블렛을 추가합니다. 부드럽게 테아제 억제제의 정제를 해산하기 위해 솔루션을 섞는다. </li><li> ultracentrifugation에 따라 신중하게, supernatants를 부어 흡착제에 초원 심 분리기 튜브를 반전하고, 단단히 초과 뜨는을 제거하기 위해 튜브를 누릅니다. 시각화에 도움을 마커 각 막 펠렛의 위치를​​ 표시합니다. 부드럽게 600 μl 수정 막 resuspension 버퍼의 각의 8 멤브레인 알약을 resuspend. 부드럽게 멸균 튜브에이 여덟 산탄, 그리고 수영장 결과 멤브레인 resuspensions을 resuspend 여덟 튜브의 다음 세트 각 막 resuspension을 전송합니다. 그것이 멀리 튜브의 벽에서 필스 때까지 pelleted 점막이 resuspend하기 어려운되므로, 펠렛을 통해 수정된 막 resuspension 버퍼를 통과 계속합니다. 그것은 종종 resuspension 과정에서 튜브 벽 및 원조에서 멤브레인 펠렛를 긁어 micropipette 팁을 사용해야합니다. pipetting 때, 얼굴이 볼만 피하거나 거품이 형성. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. </li><li> 멤브레인 알약이 resuspended 모든 16 튜브에서 제거된 경우, 수정된 멤브레인 resuspension 버퍼 600 μl와 매 4 튜브를 씻으십시오. 세척은 각 튜브의 표시 영역 (막 펠렛) 주변에 집중해야합니다. 막 resuspension 튜브로 세척을 전송합니다. 네 튜브의 나머지 세 세트를위한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 응집 물질의 감소에 DNA와 도움을 손상시키고 실온에서 30 분 부드러운 락을 함께 막 resuspension을 품어. </li><li> 막 현탁액의 작은 나누어지는을 제거하고 전체 멤브레인 수율을 결정하는 단백질 부량을 수행합니다. 우리는 일반적으로 undiluted 준비, 1:1 (2.5 % SDS)을 희석하고, 1시 3분 90시 (2.5 % SDS)를 막 샘플, 열 샘플을 희석 ° 10 분, 그리고 수치 BioRad DC의 단백질 분석을 사용하기 위해 C 막 resuspension 단백질 농도. 총 단백질 수율 1.0 MG / ML 1.6 MG / ML 사이에 일반적으로있다. 열과 SDS의 사용은보다 정확한 단백질 부량 값을 얻을 수 있도록 압축이 풀린 세포막에서 OMPs을 해제해야합니다. </li><li> 55%, 50 %, 45 %, 다음 순서대로 14 X 95mm 울트라 클리어 초원 심 분리기 튜브로 겹겹이 1.8 ML 자당 솔루션의 각 (WT / WT, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5의 준비)에 의해 선형 자당의 그라디언트 준비 40 %, 35%, 30 %. 자당의 그라디언트의 겹겹이는 전구의 pipettor 아니라 자동 pipettor를 사용할 때 수행하는 가장 쉬운 방법입니다. </li><li> 막 resuspension 단백질 양을 정함 (단계 16), 레이어의 각 그라디언트 위에 막 resuspension 1.5 MG에 따라. 각 14 X 95mm의 초원 심 분리기 튜브는 10.8 ML은 단계 17에서 자당 솔루션에 의해 차지하는 것을 주어진 최대 12.5 ML의 용량과를 가지고, 당신은 그라디언트마다 막 resuspension 이상의 1.7 ML를 로드할 수 없습니다. 모든 튜브는 (± 0.01 g) 같은 무게 때문에 각 자당 기울기 관의 마지막 무게를 (막 resuspension를 추가하거나 제거하여) 개별적으로 무게와 신중하게 조정합니다. </li><li> 4 17 H 최소 256,000 X G (38,000 RPM) ° C.에서 SW - 40Ti 스윙 버킷 로터와 원심 분리기에 자당의 그라디언트를 전송 </li></ol> 주 4 : 자당 기울기 분수 수집 <ol><li> 원심 분리 17 H 후, 원심 실행을 중지하고, 조심스럽게 SW - 40Ti의 회전자에서 자당의 그라디언트를 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 자당 기울기 튜브의 아래쪽, 바늘을 조심스럽게 청소21g 바늘로 튜브의 아래쪽, 그리고 무균 microfuge 튜브에 그라디언트에서 순차 500 μl 분수를 수집합니다. 이후 그라디언트에 대한 반복합니다. 기울기가 중력의 흐름에 의해 똑 수 있어야하므로 같은 자당 기울기를 방해하지 않습니다. 흘리지는 그라디언트 튜브의 바닥에서 멈추면 경우, 압력 소량 하나의 손가락을 사용하여 튜브의 상단에 적용할 수 있습니다. </li><li> 굴절계를 사용하여 각 자당 기울기 분율의 굴절률을 결정하고 G / ML 1 특정 밀도 굴절률을 상관 관계. nitrocellulose로 전송, SDS - PAGE 분리, 그리고 immunoblotting, 대표 자당 기울기 분수 (1.11에서 G / ML 1.26 G / ML에 0.01의 밀도 증가)을 준비하여 단백질 지방화을 평가합니다. </li></ol> 대표 결과 두 종류의 메신저와 OM의 vesicles의 완전한 분리에 제대로 수행이 절차 결과 (예 : SchuS4)과 B 타입의 F. (예 : LVS) 종자 tularensis. 그림 1, F. 대표 immunoblots에 표시 tularensis의 OMPs는 1.17 및 1.20 g / ML의 밀도 사이에 집중. 비교함으로써, IMPs는 1.13 및 1.14 g / ML의 밀도 사이에 집중. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. F.의 Immunoblotting tularensis의 자당 밀도 기울기. 연속 분수는 그라디언트와 밀도 (g / ML) 굴절 지수에 기초하여 계산되었다에서 수집되었다. 단백질은 SDS - PAGE로 구분하여 nitrocellulose로 전송하고, OMP 그리고 IMP 분별 (분리)을 감지 immunoblotted했다. MW는 크기 (KDA)를 각 얼룩의 왼쪽에있는 언급과 분자량 표준을 prestained. F.의 LVS, 전체 세포 lysates tularensis의 LVS. 해당 자당 기울기 분율의 밀도는 각각의 차선 위에 설명되어 있습니다. 로 왼쪽 여백에 명시된 바와 같이 OMPs와 IMPs는, polyclonal, monospecific antisera과 함께 발견되었다. 비슷한 결과는 F.에 대한 취득했다 tularensis SchuS4.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 spheroplasting, 삼투 용해의 변화 및 기타 세포 구성 요소 2, 3, 4의 물리적 분리 및 그람 음성 세균 OMS의 농축에 대한 자당 밀도 기울기 원심 분리 &quot;금 표준&quot;을 설명합니다. 우리는 이전에 두 종류의 OMS를 분리를위한이 방법의 응용 프로그램을 설명하는 반면 F.의 A와 타입 B의 종자 tularensis 5, 프리젠 테이션은 OM 격리에 대한 자세한 최적화 절차를 제공합니다. 사실, 이것은이 치명적인 병원균의 잠재적 표면 노출과 추정 독성 요인을 식별에 중요한 발전이다. 이 절차의 중요성은 악성 타입 F.에 대한 실질적인 보호를 여유 정화 OMPs과 생쥐의 예방 접종을 보여주는 우리의 실험실에서 연구에 입증되었다 tularensis 폐 도전 6. 세균성 세포 삼투 용해 중에주의 모니터링 및 멤브레인 알약의 부드러운 resuspension의 위에 바와 같이, 성장 단계는이 막 분리 절차의 성공 / 실패와 연관시키는 것은 나타나지 중요한 단계입니다. 이 최적화 방법은 엄격한 일부 실험적인 변화에 따라 달라질 수 있지만, 결과 OMS는 세제의 사용, 염화 리튬이나 나트륨 탄산 7, 8, 9, 10, 11 얻고 사람에 비해 현저하게 향상된 순결이 될 것처럼, 12.

<table><tbody><tr><td>Donor calf serum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro molecular grade dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>38.5 ml polycarbonate bottle</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Abbe benchtop refractometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis는 그람 음성 세포 coccobacillus와 zoonotic 질병 tularemia의 원인이되는 에이전트이다. 다른 세균성 병원균, 매우 낮은 전염성 선량 (&lt;10 CFU), 신속한 질병의 진행, 높은 병적 상태와 사망률 요금은 Francisella의 악성 변종이 소설 독성 요소를위한 인코딩하는 것이 좋습니다 비교하면. 표면 노출 분자, 즉 외부 멤브레인 단백질 (OMPs)은 세균의 호스트 바인딩 세포, 항목, 세포 생존, 독성 및 면역 회피을 촉진하기 위해 표시되었습니다. OMPs을 공부에 대한 관련 성은 더 이상 그들은 세균성 질병의 숫자에 대한 보호 백신으로 사용할 수있다는 사실에 의해 강조합니다. OMPs는 원심 분리 및 / 또는 세제 추출 다음 세포의 sonication을 포함한 대량 막 추출 기술을 통해 그람 음성 박테리아에서 추출 수있는 반면에, 이러한 준비는 종종 periplasmic 및 / 또는 세포질 (내부) 멤브레인 (IM) 오염 물질로 오염된 있습니다. 년 동안, 그람 음성 메​​신저와 외부 세포막의 생화​​학과 biophysical 분리의 &quot;금 표준&quot;방법 (OM) 자당 농도 구배 원심 분리에 의해 다음, spheroplasting 및 삼투 용해에 따라 박테리아되었습니다. 일단 자당 기울기에 겹쳐, OMS는 낙관적인 밀도의 차이에 따라 인스턴트 메시지에서 분리 크게 OM에서 lipopolysaccharide의 존재 (LPS)에 predicated 것으로 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 풍부하게, 그리고 F.을 분리하기 위해 엄격한하고 최적화된 방법을 설명 tularensis 외부 세포막과 관련 OMPs.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

에서 내부와 외부 세포막을 분리를위한 프로토콜<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 밀도 기울기 ultracentrifugation에 의해.

의 분리를위한 방법 Francisella tularensis 아웃터 세포막

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

17.0K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. 에서 내부와 외부 세포막을 분리를위한 프로토콜 Francisella tularensis spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 밀도 기울기 ultracentrifugation에 의해.

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

연구

화학

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

생체공학

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the majority of exogenous fatty acids are present within host lipoprotein particles. Uncertainty remains as to the reservoirs of host fatty acids and the mechanisms by which bacteria extract fatty acids from the lipoprotein particles. In this work, we describe protocols for enrichment of low-density lipoprotein (LDL) particles from chicken egg yolk and determining whether LDLs serve as fatty acid reservoirs for S. aureus. This method exploits unbiased lipidomic analysis and chicken LDLs, an effective and economical model for the exploration of interactions between LDLs and bacteria. The analysis of S. aureus integration of exogenous fatty acids from LDLs is performed using high-resolution/accurate mass spectrometry and tandem mass spectrometry, enabling the characterization of the fatty acid composition of the bacterial membrane and unbiased identification of novel combinations of fatty acids that arise in bacterial membrane lipids upon exposure to LDLs. These advanced mass spectrometry techniques offer an unparalleled perspective of fatty acid incorporation by revealing the specific exogenous fatty acids incorporated into the phospholipids. The methods outlined here are adaptable to the study of other bacterial pathogens and alternative sources of complex fatty acids.

This method provides a framework for studying incorporation of exogenous fatty acids from complex host sources into bacterial membranes, particularly Staphylococcus aureus. To achieve this, protocols for the enrichment of lipoprotein particles from chicken egg yolk and subsequent fatty acid profiling of bacterial phospholipids utilizing mass spectrometry are described.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

생화학

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

면역학 및 감염병학

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the current lack of an approved tularemia vaccine for humans, research is focused on vaccine development utilizing appropriate animal models. The Fischer 344 rat has emerged as a model that reflects human susceptibility to F. tularensis infection, and thus is an attractive model for tularemia vaccine development. Intratracheal inoculation of the Fischer 344 rat with F. tularensis mimics pulmonary exposure in humans. The successful delivery into the rat trachea is critical for pulmonary delivery. A laryngoscope with illumination is used to properly intubate the tracheae of anesthetized rats; the correct placement within the trachea is determined by a simple device to detect breathing. Following intubation, the F. tularensis culture is delivered in a measured dose via syringe. This technique standardizes pulmonary delivery of F. tularensis within the rat trachea to evaluate vaccine efficacy.

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

This protocol describes intratracheal inoculations of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. This procedure mimics pulmonary exposure of humans to this potential biothreat agent and can be used to test vaccine and therapeutic efficacy against pulmonary tularemia.

Intratracheal 접종의 Fischer 344 쥐 Francisella tularensis 와

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to assess the purity of the bilayers. The OM has an increased overall density compared to the inner membrane, largely due to the presence of lipooligosaccharides (LOS) and lipopolysaccharides (LPS) within the outer leaflet. LOS and LPS molecules are amphipathic glycolipids that have a similar structure, which consists of a lipid-A disaccharolipid and core-oligosaccharide substituent. However, only LPS molecules are decorated with a third subunit known as the O-polysaccharide, or O-antigen. The type and amount of glycolipids present will impact an organism&#8217;s OM density. Therefore, we tested whether the membranes of bacteria with varied glycolipid content could be similarly isolated using our technique. For the LPS-producing organisms, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli, the membranes were easily isolated and the LPS O-antigen moiety did not impact bilayer partitioning. Acinetobacter baumannii produces LOS molecules, which have a similar mass to O-antigen deficient LPS molecules; however, the membranes of these microbes could not initially be separated. We reasoned that the OM of A. baumannii was less dense than that of Enterobacteriaceae, so the sucrose gradient was adjusted and the membranes were isolated. The technique can therefore be adapted and modified for use with other organisms.

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negative bacteria produce two spatially segregated membranes. The outer membrane is partitioned from the inner membrane by a periplasm and a peptidoglycan layer. The ability to isolate the dual bilayers of these microbes has been critical for understanding their physiology and pathogenesis.

아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. It has been discovered and rigorously studied using the patch-clamp technique for almost three decades. Its basic role of translating tension applied to the cell membrane into permeability response makes it a strong candidate to function as a mechanoelectrical transducer in artificial membrane-based biomolecular devices. Serving as building blocks to such devices, droplet interface bilayers (DIBs) can be used as a new platform for the incorporation and stimulation of MscL channels. Here, we describe a micropipette-based method to form DIBs and measure the activity of the incorporated MscL channels. This method consists of lipid-encased aqueous droplets anchored to the tips of two opposing (coaxially positioned) borosilicate glass micropipettes. When droplets are brought into contact, a lipid bilayer interface is formed. This technique offers control over the chemical composition and the size of each droplet, as well as the dimensions of the bilayer interface. Having one of the micropipettes attached to a harmonic piezoelectric actuator provides the ability to deliver a desired oscillatory stimulus. Through analysis of the shapes of the droplets during deformation, the tension created at the interface can be estimated. Using this technique, the first activity of MscL channels in a DIB system is reported. Besides MS channels, activities of other types of channels can be studied using this method, proving the multi-functionality of this platform. The method presented here enables the measurement of fundamental membrane properties, provides a greater control over the formation of symmetric and asymmetric membranes, and is an alternative way to stimulate and study mechanosensitive channels.

Bacterial mechanosensitive channels can be used as mechanoelectrical transducers in biomolecular devices. Droplet interface bilayers (DIBs), cell-inspired building blocks to such devices, represent new platforms to incorporate and stimulate mechanosensitive channels. Here, we demonstrate a new micropipette-based method of forming DIBs, allowing the study of mechanosensitive channels under mechanical stimulation.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...