우리는 촬영 및 비디오 제작에서 중요한 역할 딕 폴리와 레이 킴볼 감사드립니다.

1. 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC) 절연 <ol><li> 혈액 샘플을 구합니다 - 피를 주사기 혹은 혈액 튜브의 수집과 염증을 방지하기 위해 헤파린 (1시 50분 비율)과 함께 안티 coagulated해야합니다. 약 1 × 혈액 ML 당 10 6 PBMC의 수율을 기대 - CD4 양성 (CD4 +) T 세포 될 약 40 % 중. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브, 튜브 당 25 ML로 나누어지는 혈액을. 혈액이 분리된 경우, 부드럽게 플라즈마를 배포하기 전에 aliquoting 믹스 </li><li> , 40 ML과 Ficoll 11 ML을 그림으로써 밑받침으로 전체 볼륨을 가져 혈액 튜브에 삽입하고, 조심스럽게 피펫에서 pipet 보조를 제거, PBS를 추가합니다. ficoll 천천히 튜브의 바닥에 배수됩니다. 수준이 같도록되면 서서히 혈액 튜브에서 피펫을 제거하고 폐기. </li><li> 혈액 튜브를 모자 Aerosolve 용기로 이동합니다. 노 브레이크 - 단단히 900의 용기와 원심 × g 20 분 동안을 닫습니다. 그것은 제동 힘은 세포의 레이어를 방해하므로 아무런 제동이 스핀의 끝에 적용되지 않습니다 것이 중요합니다. </li><li> 스핀 후 PBMCs는 노란색 플라즈마 (위)와 투명 ficoll (아래) 사이에는 뚜렷한 흰색 레이어를 형성한다. 부드럽게 전송 피펫과 새로운 튜브로 전송을 사용하여 백혈구 층을 우유. 일부 플라즈마와 Ficoll이 PBMCs와 그립지만, 붉은 세포 계층의를 그리기 피할 수 있습니다. 일반적으로 2 혈액 튜브는 펠렛의 크기를 증가하려면이 단계에서 한 셀 관에 조합하여 사용할 수 있습니다. </li><li> aerosolve 용기에 낮은 브레이크 - 500 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × 15 분 동안 g을 추가합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록 돌봐, 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 기음 </li><li> 각각의 튜브에 5-6 ML를 추가하고 부드럽게 대단히 짧은 시간을 제거하는 혼합에 의해 용혈성 버퍼 처리합니다. 더 이상 5 분 이상의 알을 품다. </li><li> 10 분 230 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × g 추가 - 낮은 브레이크. Aerosolve 용기 이러한 느린 놀이를 위해 더 이상 필요하지 않은 있습니다. </li><li> 두 번 씻으 : 대기음 액체 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 분 동안 230 × g에서 PBS와 원심 분리기와 튜브를 입력합니다. </li><li> 전에 최종 세척 단계로, 다시 정지 세포 나누어지는를 제거 trypan과 청색의 희석과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이 셀 개수는 T 세포 분리 단계에서 사용되는 시약 볼륨을 지시합니다. </li></ol> 2. CD4 + T 세포 분리 * <ol><li> 액체를 기음과 10000000 세포 40 UL에 전체 볼륨을 가지고 실행 버퍼를 추가합니다. 보통이 30 버퍼 UL 플러스 잔여 펠렛 볼륨이 필요합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관이 볼륨을 전송합니다. </li><li> 10 분 얼음 10,000,000 세포 당 10 UL, 캡 튜브, 장소 - CD4 격리 키트에서 항체 칵테일 추가 </li><li> , 얼음 튜브를 제거 뚜껑을 제거하고, 10,000,000 세포마다 버퍼를 실행하는 30 UL을 추가 </li><li> CD4 격리 키트에서 자기 구슬을 추가 - 20 10000000 세포 당 UL, 캡 튜브, 그리고 15 분 동안 얼음에 장소 </li><li> 10 분 230 × g에서 세척하고 원심 분리기로의 버퍼를 실행 십 볼륨을 추가합니다. </li><li> 스핀 동안, 당신의 작업 공간에있는 자석 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 설정 </li><li> , 세포 펠렛에서 액체를 대기음이 ML 실행 버퍼를 추가하고 전송 피펫을 사용하여 대단히 짧은 시간을 제거 </li><li> 동일한 전송 피펫을 사용하여 15 분 자석에 5 ML 튜브 및 부화에 세포를 전송 </li><li> 조심스럽게 반전 자석에 의해 표시 15 ML 튜브에 + 세포 분율을 CD4을 가만히 따르다 모든하지만 마지막 한 방울까지 비우기 </li><li> 5 ML 튜브에 버퍼를 실행하는 또 다른이 ML을 추가하고 자석에서 제거 </li><li> 부드럽게 튜브의 측면과 표시 15 ML 튜브로 전송 해제 CD4 - 세포를 씻어 </li><li> 각 튜브 2 ML T 세포 매체를 추가, 10 분 동안 230 × g에서 셀 카운팅 및 원심 분리기에 대한 aliquots를 제거합니다. </li><li> trypan과 청색의 세포 aliquots을 희석하고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이러한 세포 카운트는 확장 문화 단계에 사용되는 우물의 수를 지시합니다. </li></ol> 2.11 - * 또는 Mac에서 열 및 구슬 (Miltenyi Biotec), AutoMACS 세포 분리기 (Miltenyi Biotec) 또는 Robosep 전지 세퍼레이터 (줄기 세포 기술) 단계 2.2 대신에 지시를 생산에 따라 사용할 수 있습니다. 3. 체외 확장 문화 <ol><li> CD4에서 액체를 기음 + 및 셀 카운트에 따라 CD4 세포의 산탄하고, 문화 미디어 (일반적으로 3,000,000 CD4 + ML 당 세포 10000000 ML 당 CD4 - 세포가 문화를 설정하는 잘 동작)을 추가합니다. 확장 문화 3-5000000 CD4 - 세포마다 잘과 2-3000000 CD4 + 48 자 문화 플레이트 1 ML 문화 미디어의 총 볼륨에 잘 따라 세포를 필요로합니다. 일반적으로 CD4 + 세포는 제한 인구 아르 </li><li> 원하는 경우, CD4 - 세포 (5,000 래드 비추다<html> S). 각각 300-500 μL를 추가하여 48 잘 접시에 우물의 해당 번호로 나누어지는의 CD4 세포. 1 시간 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. CD4 세포 자기편은 확장 문화에 항원 제시 세포로 될 것입니다. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 신선한 미디어 500 UL을 추가하고 부드럽게 12-20 시간을 아래 pipetting하고 전송 pipet을 사용하여 액체를 모두 제거하여 우물을 씻으십시오. 이 세차 자기편 항원 제시 세포의 레이어 뒤에 떠날 것입니다. </li><li> 세탁이 완료되면, 각 우물의 바닥 (약 100 UL)에 서부 유럽 표준시에 충분 미디어를 추가합니다 - 그렇지 않으면 자기편 세포 밖으로 건조합니다 </li><li> 각 잘하는 2-3000000 CD4 + 세포를 추가합니다. 필요한 경우 각 물론 최대 1 ML의 전체 볼륨을 가지고 추가 미디어를 추가할 수 있습니다. </li><li> 각 잘하기 원하는 펩타이드를 추가합니다. 자극에 대한 전형적인 농도는 10 UG / ML 최종 수 있습니다. </li><li> 7 일 동안 37 ° C 배양기에 넣어 판. </li><li> 칠일 후에 Hemogen 50 UL을 추가 IL - 2 (또는 재조합 IL - 2, 10 IU / ML으로 이에 상응하는 금액) 각각 잘 수 있습니다. </li><li> 이후의 각 날, 현미경을 사용하여 세포 성장을 모니터링합니다. 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL을 추가, 아직 미디어의 절반을 제거하여 합류하지 우물 피드. , 세포를 resuspending 빈 잘하는 세포의 절반을 이동, 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL 추가하여 합류 우물을 분할. 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li><li> 확대 세포는 문화의 13-15일 후 tetramer 준비가 완료됩니다. </li></ol> 4. tetramer의 얼룩에 의해 T 세포를 떠올리 <ol><li> 구입하거나 자극 CD4 + T 세포를 (tetramer 시약의 출처에 대한 논의를 참조)과 일치하는 펩타이드 / MHC 조합에 맞게 tetramers 조립. Tetramers는 ~ 0.5 MG / ML 솔루션해야합니다. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다 </li><li> 조심스럽게 각 우물에서 미디어의 절반을하다 </li><li> 5 ML의 폴리스티렌 외과 튜브로 - 일반적으로 75 μL 또는 약 50,000 세포 - 각 우물에서 세포의 나누어지는를 전송 </li><li> 50 μL 총 부피 당 일반적으로 1 μL - - 및 37 자리 1~2시간에 대한 ° C 배양기 tetramer를 추가합니다. 대조군으로 일치하지 않는 tetramer 각 우물에서 세포의 두 번째 나누어지는를 얼룩 또한 것이 좋습니다입니다. </li><li> 각 항체의 3-10 μL를 추가하여 안티 - 인 경우에는 3 번 CD, 안티 - CD4, 및 안티 CD25 항체와 레이블 셀. 추가 또는 대체 항체 마커를 사용할 수 있습니다. 이 채널은 tetramers을 위해 예약되어 있어야합니다 때문에 그러나, PE 라벨이 항체를 사용하지 마십시오. 추가 전지를 사용하는이 시점에서, 또한 라벨 단일 색상이나 isotype 제어합니다. </li><li> 얼음이나 4 15~30분에 대한 품어 항체 라벨 세포 ° C. </li><li> 0.5-2 ML 10 분 동안 230 × g에서 버퍼와 원심 분리기를 실행하는 각 튜브를 씻으십시오. </li><li> 외과 튜브에서 조심스럽게 가만히 따르다 액체. 이후 외과 분석을위한 대상 컨테이너 (선호 얼음) 모든 튜브를 저장합니다. </li></ol> 5. 흐름 Cytometer 수집 및 분석 <ol><li> 참조 비즈를 사용하여 흐름 Cytometer를 보정합니다. </li><li> 악기 설정을 확인합니다 : <ol><li> 흠없는 제어 셀 또는 isotype 컨트롤을 사용하여 가능한 림프구 게이트 (FSC 대 SSC)의 위치를​​ 조정합니다. 각 축의 첫 번째 decade 아래의 인구 (게인 설정을 변경하여)을 중심으로하여 모든 채널에서 자동 형광을 제거합니다. </li><li> 단일 색상 제어 튜브, 각 단일 색상에 대한 올바른 quadrants 내에 센터 이벤트 (보정 설정을 변경하여)를 사용. </li><li> 없는 tetramer 물들일 튜브를 사용하여 악기 설정의 미세한 조절을 마십시오. tetramers 자주 항체 컨트롤보다 밝은 얼룩 때문에 PE 채널에 대한 특정 설정에서 조정이 필요할 수 있습니다. 없는 tetramer는 CD4의 &lt;0.5 % + 세포를 얼룩해야합니다. </li></ol></li><li> 각각의 튜브에 대한 데이터를 수집 <ol><li> 각 샘플 튜브와 대조군 튜브에 대한 이벤트를 수집 </li><li> analysys 최소한 20000 이벤트를 수집 및 저장 </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 가져오기 데이터 파일 외과 분석 소프트웨어 (예 : CellQuest 소프트웨어, WinMDI 또는 FlowJo)로. 없는 tetramer를 사용하여 튜브 스테인드를 사용하여 분석을 시작합니다. </li><li> 플롯 FSC 대 SSC하고 라이브 lymphocytes (그림 1, 왼쪽 상단 패널) 주위에 게이트를 그립니다. </li><li> 플롯 CD4 대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD +와 CD4 주변 성문을 그릴 (오직 lymphocytes을 보여 게이 티드) + 인구 (그림 1 오른쪽 상단 패널). </li><li> 플롯 CD4 대 Tetramer (단 인 경우에는 3 번 CD +의 lymphocytes을 보여주 게이 티드) 및 사분면의 경계를 설정할 수 있도록 CD4 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 왼쪽 아래 패널)입니다. </li><li> 플롯 CD25 대 Tetramer 및 CD25 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 오른쪽 하단 패널)가되도록 사분면의 경계를 설정 (CD4 + lymphocytes만을 보여주 게이 티드). </li><li> 성문을 변경하지 않고 샘플 튜브를 모두 분석할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>1167/JOVE %의 20FIGURE의 % 201.png &quot;고도 =&quot;그림 1 &quot;너비 =&quot;600 &quot;높이 =&quot;342 &quot;/&gt; 그림 1. 대표 대조군의 tetramer의 얼룩 결과. 왼쪽 상단 패널은 앞으로 스캐터 구절 사이드 분산 및 림프구 크기 게이트 (R1)을 보여줍니다. 오른쪽 상단 패널은 R1에 대한 문이 있으며, 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD + (R2)와 CD4 + (R3) 게이츠 대 개미 - CD4를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널은 R2에 대한 문이 있으며, tetramer 대 안티 CD4를 보여줍니다. 오른쪽 아래 패널 R3에 대한 문이하고 안티 CD25 대 tetramer를 보여줍니다. 두 tetramer의 플롯에 대한 quadrants은 0.5 %로 설정했다. 6. 대표 결과 <ol><li> tetramer 긍정적인 세포는 CD4 + 세포를 확장합니다 (그림 2) 사이에 뚜렷한 인구해야합니다. </li><li> Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. </li><li> 어떤 경우에는 MHC / 펩타이드 결합 배경 얼룩을 (종종 가난한 용해도와 펩타이드에 의한) 제공할 수 있습니다. &quot;거짓 긍정적인&quot;세포 Tetramer 또는 CD25 대 Tetramer의 플롯 (그림 3) 대 CD4 중 하나에 하나의 뚜렷한 인구하지 않기 때문에 이러한 배경 얼룩은 진정한 긍정에서 차별화된 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> 그림 2. 대표 긍정적인 tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 긍정적인 세포가 백신 CD25 대 tetramer 패널에 tetramer 패널과 별개의 CD25 + 인구 대 안티 - CD4에 뚜렷한 CD4 높은 인구로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="그림 3" width="600" height="336" /> 그림 3. 대표 &quot;거짓 긍정&quot;tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 패널 대 안티 CD4는 뚜렷하지 &quot;mounded&quot;얼룩을 보여줍니다. 안티 CD25 대 tetramer 또한 CD25 +되는 방향으로 알 수없는 추세 &quot;mounded&quot;얼룩을 보여줍니다.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetrame...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T - 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 ​​시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 - 비오틴 분류 자​​석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL - 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 - CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K 조회수.  Benaroya Research Institute. 이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

비디오: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

연구

생물학

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서

판막병 내피 세포의 분리

의 세포 구체적인 분석

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

의 발달 프로세스 추적 및 정량화

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

요약

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CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서

판막병 내피 세포의 분리

의 세포 구체적인 분석

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

의 발달 프로세스 추적 및 정량화

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석