마우스 모델에서 마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-Computed Tomography and Blood Sampling)을 사용한 폐결절 진행 모니터링

이 프로토콜은 폐 결절을 연구하기 위한 효율적이고 간단하며 최소 침습적 방법을 설명합니다. 상악하 정맥 혈액 채취 및 마이크로 CT 영상이 조사 기법으로 사용됩니다.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)은 폐 결절(PN)에서 폐암(LC)으로의 변화를 모니터링하기 위한 직관적이고 민감하며 최소 침습적인 실시간 기술입니다. 턱밑 정맥 혈액 샘플링의 통합은 PN이 LC로 진행되는 동안 이미징 및 주요 표적 변경을 빠르고 안정적이며 간단하게 감지할 수 있습니다. 본 연구에서는 폐선암 모델을 개발하기 위해 A/J 마우스에서 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄온 100mg/kg을 투여하였다. 그런 다음 턱밑 정맥 혈액 샘플링 및 마이크로 CT 분석을 통해 실험 동물의 질병 진행을 모니터링했습니다. 실험 결과에 따르면 10^주째까지 일부 동물의 폐에 결절성 병소가 존재하며, 21주차까지 폐선암종 영상의 발달이 분명해졌습니다. 결론적으로, 마이크로 CT는 효과적으로 쥐의 폐에 있는 병리학적인 변화를 관찰할 수 있고, 턱밑 정맥 혈액 표본 추출과 결합될 때, 혈액, 단백질 및 표적에 있는 변화를 동적으로 감시할 수 있습니다. 이 방법은 약물 스크리닝, 약동학 검사, 독성 실험 및 안전성 연구를 위한 매우 특이적이고 간단하며 민감한 접근 방식을 제공합니다.

폐암(LC)은 기관지 점막 또는 폐샘에서 발생하는 심각한 신생물입니다. 2021년 통계에 따르면 LC는 매년 전 세계적으로 약 200만 명의 사망자를 발생시키며 발병률과 사망률은 증가하고 있습니다¹. LC에 대한 조기 진단과 개입은 치료율을 높이고, 폐사율을 줄이며, 치료 비용을 낮추는 데 기여합니다. 폐 결절(PN)은 LC의 특이적 전구체로, 방사선 검사에서 폐 허탈, 종격동 림프절 확대 또는 흉막 삼출의 증거가 없는 국소적이고 둥글며 밀도가 높은 고체 또는 준고체 그림자≤ 특징이 있습니다². 2022년 미국 국립종합암네트워크(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)는 PN을 수, 직경, 밀도에 따라 분류하여 우측 폐에 있는 5mm 고립된 바닥 유리 결절과 같은 조합을 식별했습니다³. 그러나 NCCN 가이드라인에 따르면 PN의 악성 종양 위험은 결절의 직경과 양에 따라 증가합니다. 저선량 컴퓨터 단층촬영(CT)의 광범위한 적용으로 PN 진단이 급격히 증가했으며, 매년 수백만 건의 새로운 사례가 확인되었습니다⁴.

A/J 마우스와 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄온(NNK)의 조합은 폐암(LC)에 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델입니다^.5,6. 턱밑 정맥 혈액 샘플링과 함께 마이크로 CT를 사용하는 것은 폐 결절(PN)에서 LC로의 변화를 실시간으로 모니터링하기 위한 효과적인 접근 방식입니다. 특히 NNK 및 A/J 마우스에서 화학적 발암물질 유도는 폐암 모델링에 가장 널리 사용되는 방법이며 제자리 암종을 확립하는 데 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다 ^7,8. 이 모델링 방법은 겨드랑이 접종 방법에 비해 PN에서 LC로의 진행을 보다 정확하게 시뮬레이션합니다.

이전 연구는 안락사 후 조직 샘플의 결절 형태 및 병리학적 염색에 대한 통계적 분석에 중점을 두었다⁹. 그러나 이러한 방법은 PN에서 LC¹⁰까지의 동적 진행을 실시간으로 모니터링할 수 있는 능력이 부족합니다. 비침습적 이미징 기술인 Micro-CT는 고해상도, 빠른 이미징, 낮은 방사선량 및 안전성으로 정확한 종단 데이터를 제공하므로 실시간으로 폐 이미지를 감지하는 데 적합합니다^11,12. 턱밑 정맥 혈액 샘플링은 마우스에서 혈액 샘플을 채취하는 가장 최신의 가장 간단하고 빠른 방법입니다¹³. 이 비침습적 기술은 최소한의 동물 취급이 필요하고 빠른 회복이 가능하며, 연구에 사용되는 동물의 수를 줄이고, 불편함을 최소화하며, 윤리적 치료를 촉진하는 것을 목표로 하는 3R 원칙에 부합합니다. 수집된 혈액량(약 0.2-0.5mL)은 중간 정도의 요구 사항으로 혈액 매개변수를 모니터링하기에 충분합니다¹⁴.

마이크로 CT 및 턱밑 정맥 혈액 샘플링을 동시에 사용하면 이미징에서 PN에서 LC로의 진행을 동적으로 실시간으로 관찰하고 혈류 내 주요 표적을 실시간으로 감지할 수 있습니다¹⁵. 또한 이 접근 방식을 사용하면 대사 산물 및 기타 생화학 물질을 실시간으로 조사할 수 있으며, 이는 고성능 크로마토그래피와 같은 기술과 결합될 때 LC^16,17에 대한 이해를 향상시킵니다.

이 연구에서는 NNK와 결합된 A/J 마우스를 사용하여 현장 폐암 마우스 모델을 만들었습니다. 폐 이미지를 캡처하기 위해 모델 도입 후 4주, 10주, 20주 시점에 마이크로 CT 스캔을 수행했으며, 실험 전반에 걸쳐 턱밑 정맥 샘플링 을 통해 혈액을 수집했습니다. 본 연구는 턱밑정맥혈액 채취와 micro-CT를 결합하여 PN 및 LC 연구의 기반을 구축하는 것을 목표로 합니다.

종양학에서는, 마이크로 CT는 그런 학문^18,19 도중 국부적으로 그림자 초점 변화를 언제든지 측정하기 위한 고해상도 기술을 제안하는 종양 성장 검출을 위한 매우 효과적인 공구입니다. 그러나 마이크로 CT만으로는 그림자 초점 특성, 동물의 생리학적 상태 또는 주요 생물학적 요인의 수준에 대한 정보를 제공하지 않는다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 따라서 본 연구에서는 턱밑 정맥 샘플링을 보완 방법으로 활용했습니다.

본 연구에서 기술된 모든 동물실험은 청두중의약대학의 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았으며 동물연구에 대한 관련 법규 및 윤리 기준에 따라 수행되었다(검토 번호: 2024035). 암컷 근친 A/JGpt 마우스(7-8주령)는 20-24°C의 온도와 40%-70%의 상대 습도에서 유지되었습니다. 그들은 표준 동물 사료와 12시간의 명암 주기 동안 자유로 이 정제수를 제공받았습니다. 실험 전에 각 동물은 7일 동안 이 환경에 적응했습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 시약 및 동물 제제

1. 화학 물질 및 시약
   1. NNK를 식염수에 용해시켜 10mg/mL 마스터 믹스를 형성합니다²⁰. NNK 그룹에는 100mg/kg 농도의 0.2mL를 1회 복강내 주사를 투여하는 동시에 빈 그룹에는 동일한 양의 생리식염수를 제공합니다.
      참고: Jang et ^al.21 에 따라 마이크로 CT 스캔 및 혈액 샘플링 시기를 결정합니다.
2. 혈액 채취
   알림: 생쥐의 건강을 보장하기 위해 매번 혈액 채취를 0.2mL 이하로 제한하고 회복에 1주일을 허용하십시오. 정신하 부위에 모발이 많기 때문에 채취 중 모발로 인한 혈액 샘플의 오염을 피하도록 주의하십시오.
   1. 실험 전날 적절한 면도기를 사용하여 동물의 수염을 제거합니다.
   2. 왼손으로 마우스 머리 뒤쪽의 피부를 단단히 잡아 움직임을 방지하고 마우스의 머리를 고정된 위치에 유지합니다.
   3. 채혈 바늘을 비스듬한 안와 뒤의 하악 영역에서 상악하 동맥으로 신속하게 삽입합니다. 최적의 혈류를 위해 바늘을 최소 3초 동안 제자리에 두십시오. 50-200 μL의 혈액을 수집합니다.
   4. 혈액을 EDTA 튜브에 모으십시오. 면봉을 사용하여 피부에 부드러운 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 출혈이 멈추면 마우스를 놓고 30초 동안 관찰합니다.
   5. 혈액이 응고제와 완전히 혼합되었는지 확인하기 위해 시험관을 부드럽게 저어줍니다.
   6. 일상적인 혈액 검사를 위해 수집된 혈액을 수의학 혈액 정기 검사 기기에 넣고 채취 버튼을 누른 다음 기기가 혈액을 채취하도록 합니다. 표시된 결과를 기록합니다. 남은 혈액은 안전하게 폐기하십시오.

2. 마이크로 CT에 의하여 vivo 화상 진찰

알림: 마이크로 CT 스캔을 사용하기 전에 항상 귀 태그와 같은 금속 물체를 실험 동물에서 제거하십시오. 금속 물체는 이미지에 심각한 아티팩트를 유발할 수 있습니다. Micro-CT는 일정량의 방사선을 방출합니다. 다른 실험 결과가 영향을 받지 않는지 확인합니다.

1. 장치를 시작하고 micro-CT 소프트웨어를 실행한 다음 프로브 보정 및 워밍업을 수행합니다. 스캔을 위해 마우스 전용 도구 베드를 사용합니다.
2. 새 데이터베이스를 만들고 이 검색에 대한 이름을 지정하거나 기존 데이터베이스에 연결합니다.
3. 소프트웨어 설정 창에서 매개변수를 수정합니다. X선 필터를 Cu0.06 + Al0.5로 설정하고 볼륨tage 70kV, 전류 80μA, 시야 36mm × 36mm, 360° 회전 스캐닝 및 스캔 시간 4분²²초.
4. ²³개를 스캔하기 전에 3% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 마이크로 CT 열기 viewing 화면을 열고 접착 테이프로 마우스를 도구 베드에 고정합니다. 도구 베드의 마이크로 CT 기구 내에 배치된 비위관을 사용하여 지속적으로 마취를 유지합니다.
5. 동물을 조심스럽게 기구 안으로 안내하고 실시간으로 위치를 모니터링하십시오. 적절한 버튼을 사용하여 마우스의 위치를 조정하여 가슴이 시야 내에서 완전히 보이도록 합니다.
6. 도구 베드를 90° 회전하여 마우스를 배치합니다. 버튼을 사용하여 마우스의 위치를 조정하고 폐 영역이 필드 내 중앙에 위치하도록 합니다. 그런 다음 도구 베드를 원래 위치로 되돌립니다.
7. 스캔을 시작하려면 스캔 버튼을 선택합니다. 시스템이 중단 없이 스캔을 완료할 수 있도록 하고 프로세스 중에 보기 화면을 열지 마십시오. 소프트웨어를 통해 재구성의 transaxial, coronal 및 sagittal slices를 관찰합니다.
8. 스캔 직후 이미지 품질을 평가합니다. 아티팩트 또는 흐릿한 이미지가 나타나면 스캔 절차를 반복하십시오.
9. 장치에서 쥐를 제거하고 건강을 모니터링하여 케이지로 되돌리기 전에 안정적인 상태인지 확인하십시오.
10. 실험이 끝나면 도구 베드에서 접착 테이프를 제거한 다음 베드를 청소하십시오. 데이터를 저장하고 기기를 끕니다.
11. 스트레스를 최소화하기 위해 쥐를 부드럽게 우리로 다시 옮깁니다. 케이지가 깨끗하고 적절한 침구가 있는지 확인하십시오.
12. 마취에서 회복 징후가 있는지 마우스를 모니터링합니다. 그들의 행동, 이동성 및 식욕을 관찰하십시오. 필요에 따라 음식과 물을 제공하십시오.
13. 마취 후 저체온증을 예방하기 위해 생쥐가 따뜻한 환경을 유지할 수 있도록 합니다. 필요한 경우 발열 패드나 담요를 사용하십시오.
14. 다음 주에 대해 매일 건강 검진을 실시합니다. 고통, 비정상적인 행동 또는 부상의 징후가 있는지 확인하십시오. 각 마우스에 대한 관찰 결과를 문서화합니다.
15. 쥐가 질병이나 고통의 징후를 보이면 수의사와 상담하여 적절한 개입과 치료를 받으십시오.
16. 생쥐가 완전히 회복되고 안정된 후 정상적인 주거 상태로 돌아가도록 합니다.

3. 데이터 처리 및 분석

1. 통계 및 그래프 작성 소프트웨어를 데이터 분석을 위한 유용한 도구로 사용하고 결과를 제시하는 표를 만듭니다.
2. 소프트웨어를 엽니다. 새로 생성된 데이터 테이블에서 XY 그래프를 선택하고, NNK 및 대조군에 대한 주간 데이터를 입력하고, 마우스의 체중 변화를 표시하는 차트를 생성합니다.
3. 소프트웨어를 다시 열고 새로 생성된 데이터 테이블에서 분할도를 선택하고 NNK 그룹 및 대조 그룹에 대한 혈액 루틴 데이터를 입력하고 아이콘을 생성합니다.
4. 소프트웨어에서 분석 옵션을 선택합니다. 일원 ANOVA를 사용하여 전체 데이터를 분석한 다음 t-test 구현을 통해 데이터를 검증합니다. 중요한 차이점을 표시합니다.
5. micro-CT 데이터를 SimpleViewer 형식 또는 DICOM으로 저장합니다. SimpleViewer 소프트웨어를 열고 전문 영상 의사의 지도하에 이미징 데이터를 관찰합니다. 결절에 레이블을 지정하고 제공된 측정 도구를 사용하여 그림자 볼륨을 정량화합니다.

본 연구는 NNK와 A/J 마우스를 이용하여 안정된 폐암 모델을 구축하였음을 입증하였다. 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다. 목표는 마이크로 CT 및 턱밑 정맥 혈액 샘플링을 활용하여 마우스 폐에서 폐 결절(PN)에서 폐암(LC)으로 전환되는 과정을 실시간으로 관찰하는 것이었습니다. 이에 따라 마이크로 CT 스캔과 쥐 폐에서 채취한 혈액 채취는 4주, 10?...

이 연구의 몇 가지 핵심 사항을 반복하는 것이 중요합니다. 첫째, 턱밑 정맥 혈액 채취는 상대적으로 부상이 적은 절차이지만 여전히 동물에게 어느 정도의 해를 끼칠 수 있습니다. 따라서 마우스의 부담을 줄이고 적시에 프로세스를 완료하기 위해 여러 절차를 수행해야 합니다²⁷. 둘째, 혈액 샘플 채취 전에 모발을 제거하면 샘플의 순도가 보장됩니다. ?...

저자는 공개할 내용이 없습니다.

기초 의학 대학의 Cong Huang 교수와 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 약학부의 Yan Huang 교수의 지원에 감사드립니다. 또한 Binjie Xu 박사와 Pengmei Guo 박사에게도 감사드립니다. (Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, 청두
University of Traditional Chinese Medicine)에서 악기 및 기술 지원을 제공합니다.