성별 확인 호르몬 요법을 모방한 쥐 모델 수립

이 프로토콜은 테스토스테론 또는 에스트라디올과 시프로테론 아세테이트(트랜스젠더를 위한 인간 치료에 사용됨)의 피하 투여를 통해 성별을 확인하는 호르몬 요법을 모방한 두 가지 설치류 모델의 개발, 용량 설정, 관련 바이오마커 식별 및 효과 평가를 설명합니다.

트랜스젠더(TG)는 출생 시 지정된 성 정체성과 성별이 일치하지 않는 개인입니다. 그들은 종종 성별 확인 호르몬 요법(GAHT)을 받는데, 이는 개인의 성별 정체성에 더 부합하는 2차 성징을 획득할 수 있도록 하는 의학적 개입으로, 수많은 사회 심리적 변수를 개선하는 데 일관된 결과를 제공합니다. 그러나 GAHT는 다른 신체 시스템을 표적으로 하며 아직 완전히 확인 및 특성화되지 않았지만 일부 부작용이 기록되어 있습니다. 그러므로, GAHT를 받는 TG 환자는 감염되기 쉬운 하위 집단으로 간주될 수 있으며, 위험 평가의 틀에서 특별한 주의를 기울여야 합니다(예: 대상 동물 모델의 사용을 통해). 본 연구는 GAHT를 모방한 두 가지 랫트 모델, 즉 TG 여성을 위한 GATT를 모방한 탈남성화-여성화 모델(dMF)과 TG 남성을 위한 GAHT를 모방한 탈남성화-남성화 모델(dFM)을 구현하기 위한 절차를 설명한다. 이 모델은 인간 GAT(인간 GHT)에 사용되는 것과 동일한 호르몬, 즉 β-에스트라디올과 dMF용 시프로테론 아세테이트, dFM용 테스토스테론을 투여하여 2주 동안 동일한 노출 경로로 구현되었습니다. 쥐는 치료 기간 동안 건강 상태와 잠재적으로 공격적인 행동을 평가하기 위해 매일 검사를 받습니다. 희생 시 혈액과 표적 조직을 샘플링하여 생화학적, 분자적, 조직병리학적 분석을 위해 보관했습니다. 성별에 따른 매개변수, 즉 정자 수와 음핵 크기도 평가되었습니다. 또한, 남성과 여성의 쥐 간에서 독점적으로 및/또는 우선적으로 발현되는 CYP450 동형은 GAHT의 성공을 확인하고 모델을 설정하기 위해 새로운 바이오마커로 확인 및 특성화됩니다. 갑상선 침범은 또한 내분비계의 핵심 표적으로 연구되어 왔습니다.

남성, 여성, 둘 다, 둘 다 아님 또는¹ 사이 어딘가에 있는 개인의 심리적 인식을 성 정체성이라고 합니다. 생물학적 성별(cisgender)과 일치하거나 다를 수 있습니다(트랜스젠더 - TG). TG 남성은 여성으로 태어났지만 자신을 남성으로 식별하는 개인입니다. TG 여성은 남성으로 태어나지만 자신을 여성으로 정체화한다². 현재 전 세계적으로 2,500만 명의 TG 인구가 있는 것으로 추정되며³ 이들 대부분은 성별 불쾌감(gender dysphoria)을 앓고 있으며,^{이는 자신의 성별}과 태어날 때 지정된 성별 사이의 불일치를 특징으로 하는 심리적 상태4이며, 이는 사회적 차별과 직장 및 가정에서의 어려움을 초래할 수 있으며, 종종 우울증으로 이어질 수 있다. 불안과 스트레스⁵. 이러한 이유로 TG 사람들은 종종 성별 확인 호르몬 요법(GAHT) 및/또는 성별 확인 수술을 받습니다. TG 남성의 경우 GAHT는 테스토스테론(T)(표 1), TG 여성의 경우 에스트로겐(E2)과 항안드로겐제(표 2^)의 투여가 특징입니다6.

GAHT는 일반적으로 개인의 전 생애 동안 지속되며 내분비 계 ^7,8에 지속적으로 작용합니다. 따라서 GAHT가 TG 환자의 건강에 미치는 영향과 잠재적으로 오래 지속되는 영향을 분석하는 것이 중요합니다. 더욱이, TG 환자는 일반 인구와 마찬가지로 내분비계를 GATT로 표적으로 하는 화학적 오염 물질, 특히 내분비 교란 물질(ED)에 노출되어 과잉 자극을 초래합니다⁹.

ED는 자연 호르몬의 분비, 활성화, 합성, 방출 및 결합과 같은 다양한 호르몬 및 대사 과정을 변경하여 유기체 및/또는 그 자손에게 영향을 미치는 화학 물질 그룹입니다. 발기부전은 환경, 식품 및 일상적으로 사용되는 제품(예: 플라스틱 병 및 용기, 금속 식품 캔 라이너, 세제, 난연제, 식품, 장난감, 화장품 및 살충제 등)에 널리 퍼져 있기 때문에 일반 인구는 평생 동안 지속적으로 노출됩니다¹⁰. 또한, 저용량의 발기부전 노출도 조직 및 장기 손상을 초래할 수 있으며, 발기부전 노출과 관련된 일반적인 현상은 실험실 동물과 인간 모두에서 성별에 따른 영향이 발생하는 것입니다¹¹. 예를 들어, 식품 접촉 물질인 비스페놀 A(BPA)에 대한 노출은 여성의 자궁내막증 및 다낭성 난소 증후군과 같은 건강 위험뿐만 아니라 에스트로겐 효과로 인해 생식력 감소와 관련이 있습니다¹². 남성의 경우 BPA는 수치를 낮추고 정자의 질을 떨어뜨릴 수 있다¹³. 또한 살충제는 여성의 유방암 발병 위험 증가, 남성의 경우 심각한 생식력 문제와 관련이 있다¹³. 현재까지 TG 환자에서 발기부전을 포함한 환경 오염 물질의 독성학적 영향을 연구할 수 있는 구체적인 도구는 없습니다⁹.

본 연구는 두 가지 TG 동물 모델, 즉 탈남성화-여성화 모델(dMF)과 탈남성화-남성화 모델(dFM)의 개발을 위해 선택된 방법과 매개변수를 설명하는 것을 목표로 합니다. 특히, 현재의 인간 요법에 기초하여 적절한 용량 수준, 시간 및 호르몬 투여 방법의 선택이 평가된다¹⁴. 또한, 모델을 고유하게 정의하는 조직 및 기능적 바이오마커가 식별되고 특성화됩니다. 또한, 동물에 대한 치료의 효능 및 내약성뿐만 아니라 장기 연구에 사용하기 위한 가장 적절한 마커의 선택은 이러한 목적으로 사용되는 기술과 함께 자세히 설명되어 있습니다.

모델을 특성화하기 위해 다음과 같은 종점을 분석합니다 : 테스토스테론 (T) 혈청 수치 (두 모델 모두에서 GAHT의 성공을 평가하기위한 최상의 바이오 마커 ^9,15); 에스트라디올(E2) 혈청 수치(두 모델 모두); 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 티록신(T4)(dMF 모델); 정자 수(dMF 모델); 음핵 치수(dFM 모델); 생식 기관, 간 및 갑상선의 조직 병리학적 분석(두 모델 모두). 또한, 다음과 같은 성 특이적 간 사이토크롬 P450 동형(CYP450s, 두 모델 모두)의 유전자 발현도 분석된다^16,17: CYP2C11(남성 간에서 특이적으로 발현), CYP3A18(여성보다 남성 간에서 25배 더 많이 발현), CYP2C12(여성 간에서 특이적으로 발현) 및 CYP2C6(주로 여성 간에서 발현되지만 더 낮은 수준으로 존재, 남성에서도 마찬가지입니다).

연구는 Directive 2010/63/EU, 2014년 3월 4일 이탈리아 법령 n. 26 및 OECD GLP(Good Laboratory Practice) 원칙에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 이탈리아 보건부의 승인을 받았습니다(승인 번호 806/2021-PR). 여기에서는 남녀 모두의 성적으로 성숙한 어린 Sprague-Dawley 쥐 16마리(13g 수컷 쥐 304마리와 7g 암컷 쥐 190±±, 8-9주령)를 구입하여 표준 실험실 조건(22± 0.5°C, 50%-60% 상대 습도, 시간당 12-14회의 공기 변화와 12시간의 암흑광 교대)에서 물과 먹이를 자유롭게 이용할 수 있습니다. 모든 케이지에서 각 동물의 환경 풍요로움을 위해 나무 갉아먹는 블록을 삽입하고 매주 교체하십시오.

참고 : GAHT는 설치류의 경우 8-9 주에 해당하는 청소년기 (Tanner stage 2-3)에 시작할 수 있기 때문에 8-9 주 된 동물이 선택되었으며 잠재적으로 TG people⁹의 전체 수명 동안 지속됩니다.

1. 그룹 크기 조정 및 동물 관리

1. 쥐는 OECD(예: 가이드라인 421 생식/발달 독성 스크리닝 테스트)에서 지정한 선호 종이고 OECD 가이드라인 407(설치류에서 반복 투여로 28일 경구 독성 연구, EI 검출을 위한 매개변수로 업데이트됨)에서 제안되고 고려되는 유일한 설치류 종이기 때문에 젊은 성인 수컷 및 암컷 Sprague-Dawley 쥐(8-9주령)를 모델로 사용합니다.
2. 그룹 크기 조정에는 G*Power 소프트웨어를 사용합니다. dFM 및 dMF 모델 모두에 대해 4 개의 테스트 그룹을 선택하십시오 : 1 개의 대조군 (C)과 3 개의 동물 그룹, 서로 다른 용량의 GAHT로 처리 된 동물. Mann-Whitney 검정을 사용한 두 그룹(치료 용량 대 C) 간의 비교, 양측 유의 수준 알파 = 0.0167(각 치료 용량과 C 간의 3회 비교에 Bonferroni 보정이 적용된 알파 = 0.05에 해당) 및 1-베타 검정력 = 0.80을 참조하여 크기 조정을 수행합니다.
   1. 계산된 랫트/그룹의 수는 다음과 같습니다.
      dFM 모델의 경우, 동물/그룹 n=4, Kinnear et ^al.18 에 따르면 치료 2주 후 다음 수준: 대조군: 0.2 ± 0.3ng/mL, 호르몬 요법 그룹: 16 ± 5ng/mL(평균 ± 표준 편차), Cohen의 d = 4.46(매우 큰 효과)으로 측정된 효과 차원에 해당).
      dMF 모델의 경우: 동물/그룹 n=3, Gómez et ^al.19 에 따르면 치료 2주 후 대조군: 1.901 ± 0.413ng/mL 및 호르몬 요법 그룹: 0.043 ± 0.023ng/mL(평균 ± 표준 오차)는 Cohen의 d = 6.35(매우 큰 효과)로 측정된 효과 차원에 해당합니다.
   2. 두 모델을 정렬하려면 성별/그룹당 n=4마리의 동물을 선택하여 총 N = 32마리의 동물을 선택합니다.
3. 1주일간의 순응 후, 쥐를 성별에 따라 2개의 실험 그룹(dMF 및 dFM, 4마리의 쥐/그룹)으로 나누고, 각 그룹은 1개의 C(대조군 수컷, CM 및 대조군 암컷, CF)와 선택한 GAHT의 3개의 치료 그룹으로 구성됩니다.
4. 모든 쥐를 하루에 2번(오전 8시 30분 및 오후 4시 00분) 모니터링하여 GAHT 투여로 인한 일반적인 건강 상태 및 잠재적인 공격성을 확인합니다. 실험실 동물의 체중에 최적화된 동적 가중치 기능을 갖춘 분석 저울을 사용하여 체중(bw) 및 사료 소비량을 일주일에 2회 기록합니다.
5. dFM 실험 모델에서, 정밀 판독을 위해 디지털 게이지를 사용하여 치료 시작 직전(포인트 0)과 치료 종료 직전(포인트 13)에 모든 쥐의 음핵 직경을 측정합니다.
6. 희생 전에 모든 동물의 무게를 측정하고, dMF 모델에서는 희생 직후에 정자 계수를 수행하기 위해 부고환을 제거합니다.

2. 용량 선택 및 준비

1. dFM 쥐에게 투여할 호르몬의 다음 3가지 용량을 사용하십시오: 주당 5, 10.5 및 22.5mg/kg, dMF 모델의 경우 다음 세 가지 선택된 용량 수준(DL)을 사용합니다: DL1 E2 0.045 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg, DL2 E2 0.09 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg 및 DL3 E2 0.18 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg.
   참고: 모든 용량은 TG 사람¹⁵ 에 사용된 주요 인간 임상 지침과 문헌에서 사용할 수 있는 제한된 데이터를 고려하여 선택됩니다.
2. 화학 안전 후드를 사용하여 매주 모든 재고 용액을 준비하십시오. 모든 물질을 차량으로 참기름에 적절하게 혼합하여 완전한 용해를 보장합니다.
   참고: 두 모델 모두 용량 변환 계산기(https://dosecal.cftri.res.in/)를 사용하여 변환할 용량, 용량이 설정된 종, 동물 종 및 용량을 변환할 체중을 입력합니다. dFM 모델 (표 3)의 경우, 인간 호르몬 요법, 주당 T의 최대 용량^{100 mg 20}. 쥐에서 계산 된 용량은 주당 10.5 mg / kg의 T입니다. 두 번째 용량은 쥐에서 주당 22.5mg/kg입니다¹⁸. 세 번째 용량은 주당 5mg/kg이며, 계산된 두 용량 사이에 2.1의 계수를 유지하여 식별됩니다. dMF 모델(표 4 참조)의 경우, 투여량은 인간에 대한 권장 요법²¹ 및 생체 내 연구 14,19,22를 통해 이용 가능한 데이터를 기반으로 합니다.

3. 동물 치료

1. 주사 부위의 피부를 꼬집고 들어 올려 일종의 커튼을 형성하여 T(dFM 모델)와 E2 플러스 CPA(dMF 모델)의 피하 투여를 수행합니다. 그런 다음 1mL 주사기의 바늘을 동물의 등과 평행하게 삽입합니다. 안으로 들어가면 필요한 부피(T의 경우 100μL, E2+CPA의 경우 200μL)를 천천히 주입합니다^.23.
   1. 동물을 다음과 같이 치료하십시오 : dFM 모델의 경우 참기름 (차량)에 용해 된 T 에난 테이트를 2 주 동안 2 회 / 주 (T의 피하 주사 당 100 μL)를 투여합니다. dMF 모델의 경우 참기름(차량)에 용해된 E2와 CPA 아세테이트를 2주 동안 주 5회 투여합니다(각 피하 주사당 200μL). C족의 쥐는 차량만 취급(참기름)과 같은 방법으로 처리하십시오.

4. 혈액 채취, 희생 및 조직 채취

1. 2주간의 치료 후 제사 직전에 기체 마취 시스템을 사용하여 모든 동물을 마취합니다. 투명한 폴리스티렌 유도 챔버에서 반사가 소실될 때까지 1.5L/min의 속도로 100% 산소에서 2%에서 3.5% 이소플루란까지 다양한 용량으로 마취를 유도합니다. 쥐를 가열 패드의 엎드린 자세로 놓고 심장 내 혈액 샘플링 절차 전반에 걸쳐 표준 쥐 코 마스크로 투여되는 1.5%에서 3.5%의 유지 용량으로 이소플루란의 용량을 조절합니다.
2. 5G 바늘로 21mL 주사기를 준비하여 진공을 제거합니다. 손가락으로 심장을 찡그리면서 갈비뼈 5번과 6번 사이의 구부러진 팔꿈치 지점과 대략 몸에 수직인 외흉벽(lateral thoracic wall)에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다. 일단 심실 안으로 들어가면 혈액은 모세혈관을 통해 주사기로 들어갑니다. 혈액이 뽑힐 때까지 주사기 피스톤을 천천히 계속 집어넣습니다.
3. 혈액 샘플링 후, 분당 챔버 부피의 30%-70% 변위의 충전률로 CO₂ 질식을 사용하여 안락사를 수행하기 위해 쥐를 CO₂ 챔버에 넣습니다. 2-3분 후 호흡과 심장 박동을 모니터링하여 동물의 죽음을 확인합니다²⁴.
4. 희생 제물이 끝나면 해부대에 있는 모든 동물을 앞다리는 위로, 뒷다리는 아래를 향하게 누운 자세로 놓고 핀으로 고정합니다. 동물의 복부에 소독액을 뿌립니다.
5. 고환, 부고환, 자궁, 난소, 간, 갑상선 기관을 절제합니다. 35mL의 10% 완충 포르말린(모든 장기) 또는 Bouin의 용액(고환만 해당)이 포함된 50mL 튜브에 무게를 측정하여 보관하거나 극저온 튜브(장기/튜브)에 모아 즉시 액체 질소(-80°C에서 보관)에 동결합니다.
   1. 먼저 치골에서 상복부까지 정중선의 피부를 가위로 자릅니다. 흉곽을 두 번 옆으로 절개하고 절개 부위 양쪽의 피부를 반사시켜 흉부 내장을 노출시킵니다.
   2. 먼저 생식 기관을 제거하십시오. 수컷 쥐의 경우, 복강에 위치한 타원형 쌍을 이루는 기관인 고환을 복강 내 위치(음낭)에서 제거합니다. 음낭을 잘라 고환이 튀어나와 있는지 확인한 다음 부드럽게 잡습니다. 펜치로 내장 지방을 잡은 다음 내장에서 고환을 잘라냅니다. 절제 후, 고환의 무게를 측정하고 조직병리학적 분석을 위해 Bouin의 용액에 보관합니다.
   3. 암컷 쥐의 경우 먼저 자궁을 섬세하게 움켜쥔 다음 내장 지방 조직에서 난소(양쪽 자궁 뿔 끝에 위치)를 잘라냅니다. 절제 후 난소의 무게를 잰다.
   4. 암컷 쥐와 수컷 쥐 모두 간이 위치한 복강의 오른쪽으로 이동합니다. 간은 다소엽으로 이루어진 기관으로 좌측 내측(소엽), 좌측 외측(대주), 우측 내측(소), 우측 측측(대), 미상엽, 사각엽 등 많은 부분을 식별할 수 있다²⁵. 간을 집게로 잡고 부러지지 않도록 주의하십시오. 펜치로 xiphoid 과정을 잡고 가위로 다이어프램을 완전히 자릅니다.
   5. 겸자를 사용하여 xiphoid process를 들어 올리고 복강에서 간을 추출합니다. 가위로 횡격막에서 간을 분리하십시오. 그 후, 간의 무게를 잰 후 보관하십시오.
   6. 갑상선 추출을 위해 가위를 사용하여 동물의 목을 따라 수직으로 자르고 피부와 근육 조직을 제거하고 갑상선이 위치한 기관 끝을 부드럽게 다듬습니다. 추가 분석을 위해 갑상선 보관²⁶.
6. 아래 설명된 대로 정자 수를 계산합니다.
   1. 고환을 제거한 후, 각 고환의 뒤쪽 가장자리에 부착되어 음낭에 포함된 부고환을 잡습니다.
   2. 이 실험에서는 오른쪽 부고환의 꼬리에서 정액 샘플을 채취합니다. 채취시 지방과 결합 조직의 꼬리를 가위로 청소하고 남은 부분과 분리하여 DMEM 1mL가 들어있는 페트리 접시 (35mm x 10mm)에 넣습니다. 가위로 자르고 파스퇴르 피펫으로 흐르면 내용물이 쉽게 방출됩니다.
   3. 얻은 모든 액체를 15mL 튜브로 옮기고 DMEM(희석 계수 1:10=0.1)을 사용하여 부피를 10mL로 가져옵니다. 내용물을 피펫팅하여 균질화하고 현탁액을 생성합니다. 약간 흔든 후 현탁액 10μL를 취하여 Neubauer 챔버를 로드합니다. 카메라를 로드하고 카메라를 로드한 지 3분 후에 카운팅을 시작합니다.

5. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 분석

1. 2mL 튜브에 혈액 샘플(동물당 약 2-5mL)을 수집하고 실온에서 1시간 동안 응고시킵니다. 모든 혈액 샘플을 원심분리기에서 4°C 및 3000 x g에서 15분 동안 2회 회전시킵니다.
2. 원심 분리된 혈액은 서로 다른 색상의 세 겹으로 된 다층 모양을 가지고 있습니다. 최상층은 혈장(보통 노란색 또는 투명), 혈액의 액체 부분으로 구성됩니다. 플라즈마 아래의 층은 희끄무레하거나 회색을 띨 수 있으며 버피 코트입니다. 가장 낮은 층에는 적혈구가 포함되어 있으며 색상이 짙은 빨간색 또는 밝은 빨간색으로 나타날 수 있습니다. 성호르몬 수치를 측정하려면 피펫으로 모든 샘플의 혈청을 채취하고(담황색 코트 또는 적혈구 층을 건드리지 않음) 분취량(500μL)으로 나누어 -80°C에서 보관합니다.
3. 두 모델 모두에서 ELISA 테스트를 수행하여 성호르몬 측정을 위해 샘플에서 단백질, 항체 또는 항원의 존재를 검출 및/또는 측정합니다. 직접 방법을 사용하고 각 ELISA 키트의 지침을 따르십시오. 이 연구에서는, 뒤에 오는 호르몬의 혈청 수준은 쥐에서 결정되었다: E2, 쥐 Estradiol ELISA; T, 마우스 / 쥐 테스토스테론 Elisa; TSH, 쥐 ELISA 키트 및 T4, 쥐 ELISA 키트.

6. 조직병리학적 분석

1. 다음 절차에 따라 조직의 조직학적 슬라이드를 준비합니다.
2. 추출 시 자궁, 난소, 갑상선 및 간 샘플을 10% 완충 포르말린으로 최소 48시간 동안 고정합니다.
   주의 : 화학 물질 후드 아래에서 작업하십시오. 물질/혼합물을 흡입하지 마십시오. 증기/에어로졸 생성을 피하십시오.
3. 흐르는 물에 샘플을 1시간 동안 세척한 다음 처리할 때까지 80% 에틸 알코올(C₂H₅OH)에 보관하여 세포 사멸로 인한 변형으로부터 원형질 구조를 보존합니다.
4. 15mL의 피크르산 포화 용액, 5mL의 농축 포르말린(33%-40%) 및 1mL의 빙초산으로 구성된 Bouin의 용액에 고환을 48시간 동안 고정합니다. 80% 에틸 알코올로 샘플을 세척합니다.
   주의 : 화학 물질 후드 아래에서 작업하십시오.
5. 자동 조직 처리기를 사용하여 고체 파라핀에 함유를 수행합니다. 개재 과정이 끝나면 용융된 파라핀을 붓고 얼어붙은 판에서 식힌 작은 금속 용기에 샘플을 넣어 절단을 위한 블록을 형성합니다. 원하는 절단 섹션에 따라 방향을 지정하십시오.
6. 그런 다음 회전하는 마이크로톰을 사용하여 샘플을 자릅니다. 작은 브러시를 사용하여 5-6μm 절편을 수집하고 37°C의 물에 몇 초 동안 펴 바른 다음 현미경 유리 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 몇 분 동안 수직으로 배수하도록 두고 36°C의 오븐에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.
7. 아래와 같이 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다.
   1. 슬라이드를 테르펜 기원의 투명화제(자일렌 대체물)에 5분 동안 담궈 파라핀화합니다.
   2. 다음 등급의 에탄올 시리즈를 통해 슬라이드를 담궈 슬라이드를 재수화합니다. 각 용액에 대해 딥당 2분: 100% 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 50% 에탄올 및 증류수.
      참고: 는 프로토콜의 정지 지점이 될 수 있으며 슬라이드는 몇 시간 동안 물 속에서 RT에 남아 있을 수 있습니다. 선택적으로, 슬라이드는 물에서 4 °C에서 보관할 수도 있습니다.
   3. 슬라이드를 Mayer의 헤마톡실린에 5분 동안 놓습니다. 즉시 수돗물과 함께 용기에 5분 동안 다시 옮기십시오. 섹션에서 가장 멀리 떨어진 용기의 뒤쪽 모서리로 수돗물을 흘려보냅니다. 물 속의 보라색이 더 이상 나타나지 않을 때까지 용기를 주기적으로 비우십시오.
      알림: 슬라이드에서 섹션이 벗겨지는 것을 방지하려면 슬라이드에 직접 물을 흘려보내지 마십시오.
   4. 슬라이드를 eosin Y 1% 수용액에 2분 동안 놓습니다. 슬라이드를 증류수에 15초 동안 옮깁니다. 슬라이드를 다음 등급의 에탄올 시리즈에 담궈 탈수합니다. 각 용액에 대해 딥당 15초: 50% 에탄올, 80% 에탄올, 95% 에탄올.
   5. 슬라이드를 100% 에탄올에 1분 동안 넣고 100% 에탄올로 1분 더 변경합니다. 슬라이드를 테르펜 유래의 투명화제(크실렌 대체물)에 2분 동안 놓고 2분 더 테르펜 유래의 새 투명화제(자일렌 대체물)로 변경합니다. 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 커버슬립을 놓습니다.
   6. 장착 매체로 섹션을 덮고 슬라이드 바닥에 커버슬립을 놓습니다.
      알림: 장착 매체가 슬라이드를 제자리로 당기는지 확인합니다. 커버슬립이 평평하지 않으면 제자리에 부드럽게 두드립니다. 종이 타월을 사용하여 여분의 장착 매체를 닦아냅니다.
   7. 테르펜 유래의 투명제(자일렌 대체물)에 청소용 물티슈를 담그고 슬라이드 뒷면을 닦아 물방울이 떨어지는 매체를 제거합니다. 슬라이드를 판지 조각과 같은 이동식 고체 표면에 평평하게 놓습니다. 6.7.6단계에 설명된 대로 나머지 모든 슬라이드에 커버슬립을 추가합니다. 슬라이드가 건조되고 장착 매체가 후드의 RT에서 경화되도록 합니다.
      주의 : 화학 물질 후드 아래에서 작업하십시오.
8. 염색 후 커버 슬립으로 샘플을 덮고 광학 현미경을 사용하여 평가합니다. 조직병리학적 변화는 분포, 심각도 및 형태학적 특성에 따라 설명되었습니다.
9. Shackelford et ^al.27 이 설명하고 다음과 같이 요약한 기준에 따라 변경의 심각성을 고려하여 5점 평가 척도(0-4)를 사용하여 부상 점수를 반정량적으로 수행합니다.
   등급 0: 변경 없음
   1등급: 최소 변경. 그 효과는 조직에서 거의 볼 수 없습니다. 작고 드물게 발생합니다. 10% 이하인 조직 부분에 영향을 미칩니다.
   2 학년 : 빛 변화. 작은 조직학적 변화를 나타냅니다. 이 등급은 조직 또는 그 구조가 11%에서 20% 사이의 부피 변화를 보였을 때 사용됩니다.
   3등급: 중간 정도의 변화. 변화는 조직에서 분명합니다. 정도는 조직 또는 그 구조의 21%-40% 사이에 변동이 있음을 나타냅니다
   4학년: 현저한 변화. 조직 또는 그 구조의 압도적인 조직학적 변화. 변이는 조직의 41%-100%에 영향을 미칩니다.
10. 자궁, 난소, 고환 및 갑상선에 대한 정량적 조직형태 분석을 수행합니다. 광학 현미경에 적용된 이미지 분석 시스템을 사용하여 조직 절편을 검사하고 아래에 설명된 단계를 따릅니다.
    1. 자궁: 2x 대물렌즈를 사용하여 오른쪽 자궁 뿔의 각 횡단면, 외부 및 내부 근막, 자궁 내강의 총 면적을 측정합니다. 자궁내막과 근막의 면적과 자궁내막과 근막의 면적 사이의 비율을 계산합니다²⁸.
    2. 난소: 난소의 중앙 위치에 있는 전체 단면 중 하나를 사용하여 다양한 발달 단계에서 난포를 드러냅니다. 4x 대물렌즈를 사용하여 1차, 2차, 황체, Graaf 및 폐쇄 여포를 계산합니다. Fortune²⁹에 따라 난포 분류를 수행합니다. 또한 각 샘플에 대한 난소 면적과 난포 밀도(여포 수/난소 면적 x 100)^{를 측정합니다.30}.
    3. 고환: 10x 대물렌즈를 사용하여 20개의 세뇨관/샘플을 측정합니다. 또한 총 루멘 면적, 총 면적, 세로 직경 및 횡 직경²⁸을 측정합니다.
    4. 갑상선: 다음 매개변수를 측정합니다: 여포 밀도(follicular density) (여포 수와 주어진 면적 사이의 비율, 10x objective); 간접 여포 세포 높이(무작위로 선택된 5개의 난포/샘플 40x 대물렌즈에서 여포 면적과 콜로이드 면적의 평균 비율); 여포 상피 면적과 핵 수의 평균 비율(여포 성숙을 확인하기 위해 동일한 여포에서); 여포 세포 높이(무작위로 선택된 5개의 난포/샘플에서 5개의 세포 높이의 평균, 64x 대물렌즈)³¹.

7. 유전자 발현

1. 두 모델 모두 -80°C에서 보관된 간 샘플을 사용하여 유전자 발현 분석을 수행합니다. 동물 조직의 용해물에서 시작하는 키트를 사용하여 전체 RNA 정제 프로토콜을 따르십시오.
   1. 간 용해물을 얻으려면 조직 샘플(10mg)을 미니피너로 분쇄하고 조직 샘플에 600μL의 RL BUFFER(키트와 함께 제공됨)를 추가한 다음 샘플이 균질화될 때까지 계속 분쇄합니다.
2. 추출 직후, 얻은 RNA를 정량화하고 형광분광계를 사용하여 품질(변성 또는 단백질 잔류물의 존재 여부)을 평가합니다. 핵산과 단백질이 각각 흡수하는 260 nm 및 280 nm의 파장에서 분광광도계 흡광도 판독을 수행합니다.
3. 총 RNA 농도를 평가한 후 제조업체의 지침에 따라 cDNA Synthesis Kit를 사용하여 각 샘플에서 총 RNA 1μg을 포함하는 적절한 부피를 cDNA로 역전사합니다.
4. 얻어진 cDNA를 RT-PCR로 분석합니다.
   1. 관심 유전자의 유전자 발현을 분석하기 위해 각 표적 유전자와 구성적으로 발현된 글리세르알데히드 인산염 탈수소효소(GAPDH)에 대한 특정 정방향 및 역방향 프라이머가 설계되었습니다. 웹 애플리케이션 Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)를 사용하여 관심 유전자에 대해서만 쌍의 특이성을 보장하는 최상의 프라이머를 선택하고 상업적 공급업체에서 합성한 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있습니다. 사용된 프라이머 쌍의 서열은 표 5에 보고되어 있습니다.
   2. 동결건조된 프라이머를 RNAse가 없는 증류수로 최종 농도 100mM로 재현탁합니다. 전용 키트를 사용하여 qPCR 분석을 수행합니다. 어닐링된 cDNA를 1:40으로 희석하여 20μL의 최종 부피에서 반응을 수행합니다. 각 샘플을 96웰 PCR 플레이트에 복제하여 로드합니다.
   3. 이 프로그램에 따라 열 순환기에서 qPCR 실행을 수행합니다: 95°C에서 10분 동안 1회 주기; 95°C에서 15초 동안 40회, 58°C에서 30초, 72°C에서 1분 동안 1회 주기. 마지막에 55°C에서 95°C(30s/°C)까지 해리 주기를 수행하여 증폭된 산물의 특이성을 확인합니다. 기계의 전용 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 대한 임계값 사이클 값(Cycle Threshold, Ct)을 얻습니다. Pfaffl 공식³²에 따라 결과를 ΔΔ Ct(델타 델타 Ct)로 표현합니다.
      ΔCt 타겟 유전자 = Ct Control - Ct 처리
      ΔCt Reference 유전자 = Ct Control - Ct 처리
      ΔCt = ΔCt 타겟 유전자 - ΔCt Reference gene

8. 데이터 분석

1. 스프레드시트를 사용하여 데이터 관리를 수행합니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다. 특정 소프트웨어를 사용하여 그래픽을 디자인합니다.
2. bw gain, feed consumption, absolute and relative 장기 중량, 호르몬 혈청 수치, 조직 형태 측정 데이터 및 유전자 발현 데이터를 평균 ± 표준 편차로 나타냅니다. 비모수적 Kruskal-Wallis 분석을 수행한 다음 사후 쌍별 비교(Mann-Whitney 검정)를 수행합니다.
3. 2-way Fisher Exact Test를 사용하여 조직학적 데이터를 분석하여 심각도 등급(총 발견 발생률)에 대한 참조 없이 범주에 할당된 샘플을 포함하여 대조군과의 유의미한 차이를 식별합니다. Cochran-Armitage 추세 테스트를 사용하여 용량-반응 추세를 식별합니다. p-값이 0.05< 경우 그룹 간의 차이가 유의한 것으로 간주합니다.

Tassinari et ^al.14 및 Tammaro et ^al.33에 의해 입증된 바와 같이, 다음 결과는 쥐에 대한 GATT의 성공과 모델의 적절성을 보여주었습니다.

사망률이나 공격성과 같은 비정상적인 행동은 기록되지 않았으며, 독성이나 고통의 임상적 징후(예: 활동 감소, 필로렉션, 단장되지 않은 외모)는 관찰되지 않았다¹⁴.

GAHT를 모방한 설치류 모델의 구현은 TG 사람들의 잠재적인 특정 감수성과 취약성, 그리고 일반적으로 평생 지속되는 치료법의 장기적인 결과를 연구하는 데 중요합니다.

문헌에 유사한 연구가 거의 없다는 점을 감안할 때 이 실험의 중요한 점은 모델을 설정하기 위한 용량을 선택하는 것입니다. 이러한 용량은 부작용, 독성 및/또는 사망을 일으키지 ?...

저자는 이 연구가 잠재적으로 이해 상충을 일으킬 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었다고 선언합니다.

없음.