알츠하이머병(AD)의 신경 모델에서 미토콘드리아 관련 소포막(MAM) 안정화의 정량적 분석

여기에서는 알츠하이머병(AD) 뉴런에서 신경독성 β-아밀로이드(Aβ) 생성을 실시간으로 증가 또는 유지하여 미토콘드리아 관련 소포체(ER) 막(MAM)의 구성 안정제의 축삭 수송 속도를 측정하여 MAM 안정화를 측정하고 AD 치료제 개발을 돕기 위한 직접적이고 정량적인 지표로 사용하는 방법을 설명합니다.

알츠하이머병(AD)의 3차원(3D) 신경 모델에서 미토콘드리아 관련 소포체막(MAM)의 안정화를 정량화하는 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 먼저, 가족성 알츠하이머병(FAD)을 포함하는 β-아밀로이드 전구 단백질(APP) 또는 나이브 ReN 세포를 발현하는 새로운 인간 신경전구세포 ReN 세포를 얇은(1:100) 마트리겔 코팅 조직 배양 플레이트에서 성장시킵니다. 세포가 포화도에 도달한 후, 이들은 미토콘드리아를 검출하는 AKAP1(34-63)(Mito-RFP)의 적색 형광 단백질(RFP) 접합 미토콘드리아 결합 서열 또는 타이트(6nm ± 1nm 갭 폭) 또는 느슨한(24nm ± 3nm 갭 폭) MAM을 각각 안정화하는 구성 MAM 안정제 MAM 1X 또는 MAM 9X를 인코딩하는 발현 플라스미드로 전기천공됩니다. 16-24시간 후, 세포는 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 의해 수확되고 농축됩니다. 동일한 수의 FACS가 풍부한 세포를 3차원 매트릭스(1:1 Matrigel)에 파종하고 10일 동안 성숙한 뉴런으로 분화시킵니다. RFP 접합 MAM 안정제를 발현하는 10일 분화 세포의 생세포 이미지는 CO₂ (5%), 온도(37°C) 및 습도(~90%)를 유지하는 생세포 이미징 배양 챔버가 장착된 형광 현미경으로 캡처합니다. 이를 위해 생세포 이미징 및 키모그래프 분석을 수행하여 MIM 1X 또는 MAM 9X로 안정화된 좁거나 느슨한 갭 폭의 Mito-RFP 또는 ER 결합 미토콘드리아의 운동성을 측정하기 위해 최소 500nm 길이의 각 ReN GA 뉴런의 가장 확장된 뉴런 과정에서 이를 축삭돌기로 간주하여 측정했습니다.

새로운 증거에 따르면 종종 MAM ^1,2라고 하는 미토콘드리아 관련 ER 막으로 생화학적으로 수확된 특수 미토콘드리아 관련 소포체 접촉체(MERC)가 AD ^3,4를 포함한 여러 신경퇴행성 질환에서 역할을 합니다. 이러한 MAM은 응급실과 미토콘드리아의 외막에 있는 콜레스테롤이 풍부한 지질 뗏목과 같은 미세도메인으로 구성되어 있으며, MAM 사이에 구조적 및 기능적 다양성을 생성하는 일련의 단백질로 묶여 있습니다 ^5,6,7. 최근에 만들어진 MAM 가설은 MAM의 증가가 Aβ 생성의 증가와 신경섬유다발(NFT) 형성, 칼슘 항상성 질환 및 신경염증을 포함한 AD의 병원성 연쇄 반응으로 이어진다고 가정합니다 ^3,8. 미토콘드리아의 약 5%-20%가 응급실과 신체적 접촉을 하여 MAM을 형성합니다⁹. MAM의 갭 너비는 부드러운 ER과 거친 ER(각각 sER과 rER)에 의해 결정됩니다. sER-미토콘드리아(10-50nm)와 rER-미토콘드리아(50-80nm) 사이의 가변 갭 너비는 MAM의 갭 너비가 단단(~10nm)에서 느슨한(~80nm) 사이의 긴 스펙트럼을 가지고 있음을 시사합니다10,11,12,13. MAM 갭 폭은 칼슘 항상성 및 지질 수송과 같은 MAM 기능을 결정합니다 ^1,14. 최근 보고서에 따르면 긴밀하게(~10nm) 연결된 ER과 미토콘드리아 사이에 형성된 완전 MAM이라고 하는 MAM은 세포사멸적(apoptotic)입니다. 대조적으로, 느슨하게 연결된(~25nm) ER과 미토콘드리아 사이에 형성된 MAM은 결함 또는 중간 MAM이라고 하며 항세포사멸 14,15,16입니다. 6nm ± 1nm의 갭 폭을 가진 MAM의 안정화는 AD의 새로운 3차원(3D) 신경 배양 모델에서 Aβ 생성을 증가시켰습니다. 대조적으로, 갭 폭이 24nm ± 3nm인 MAM의 안정화는 Aβ 세대¹⁷에 영향을 미치지 않습니다. 이 발견은 MAM을 불안정하게 만들지 않고 MAM 안정화 정도를 조절하는 것이 Aβ 발생을 조절하는 열쇠임을 처음으로 시사합니다. MAM을 완전히 불안정하게 만들려는 시도는 원치 않는 결과를 초래할 수 있는데, 이는 MAM이 세포 생존에 중요한 몇 가지 세포 이벤트를 유지하기 때문입니다¹².

MAM의 조절은 암, 대사 장애 및 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 장애에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 새로운 연구 분야입니다¹⁸. 많은 MAM 조절제를 사용할 수 있음에도 불구하고 MAM의 구조적 다양성으로 인해 약물 발견의 대상이 되는 매우 복잡한 시스템으로 만들기 때문에 MAM을 불안정하게 하고 AD 병리학을 낮추는 능력을 테스트하려는 주요 시도는 지금까지 이루어지지 않았습니다. 그러나 약물 표적의 특정 특성과 그 환경^18,19을 고려하는 새로 개발된 구조 시스템 약리학은 어려움을 극복하고 AD에서 MAM 또는 MAM 관련 단백질을 표적으로 하는 매우 강력한 약물을 개발해야 합니다. 그러나 MAM 안정화의 효과적인 조절제를 찾기 위해서는 MAM 안정화 정도를 정확하게 정량화하는 방법이 필요합니다. 전자 현미경(EM) 또는 초고해상도 현미경과 같은 기존 기술은 MAM 안정화를 결정하는 데 한계가 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 살아있는 세포의 MAM 안정화에 대한 정량적 측정을 제공할 수 있는 새롭고 보다 역동적인 이미징 기술 또는 생화학적 분석의 개발이 필요할 것입니다. 1차 뉴런의 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM)은 ER이 미토콘드리아 주변에 네트워크를 형성하는 경향이 있음을 밝혔습니다 미토콘드리아 운동성을 제한할 가능성이 있습니다^20,21. 미토콘드리아 수송 시스템의 붕괴는 역행성, 전행성 또는 둘 다로 시냅스 및 신경 기능에 깊은 영향을 미쳤습니다²². 따라서 MAM 안정화를 정량적으로 측정하기 위한 지표로 여기에 설명된 ER 결합 미토콘드리아의 축삭 속도에 대한 새로운 라이브 셀 이미징 및 키모그래피 기반 분석은 MAM 안정화 임계값을 Aβ 생성 증가와 반대로 유지하거나 낮출 수 있는 임계값으로 전환할 수 있는 MAM 조절제의 식별을 용이하게 할 것입니다.

AD 신경 배양 모델: 본 연구는 인간 신경전구세포(Naive ReN (Millipore)] 또는 아밀로이드 전구단백질(APP) 유전자(APP^Swe/Lon), ReN GA 세포에서 가족성 AD(fAD) 돌연변이를 발현하는 ReN 세포에서 유래한 뉴런을 사용했다. ReN-GA 3차원(3D) 배양 시스템은 AD 병리학, 즉 Aβ 올리고머 주도 신경섬유다발(NFT)을 요약합니다 ^23,24. Naive ReN cell은 상업적으로 이용 가능합니다. ReN GA 라인은 Massachusetts General Hospital (MGH) 부교수인 Dr. Doo Y. Kim으로부터 얻었습니다^.23,24,25.

발현 플라스미드: RFP(MAM 1X로 표시된 Mito-RFP-ER)와 직접 연결되거나 6nm ± 1nm 또는 24nm + 3nm 갭 폭의 MAM을 안정화하도록 설계된 9개의 아미노산 링커(MAM 9X로 표시)를 포함하는 Ubc 6(283-303) 단백질의 AKP1(34-63) 및 ER 표적 서열^15,26(그림 1A).

1. Electroporation

1. MAM 안정제로 세포 transfection(1-2시간)
   참고: nucleofector 키트의 제조업체(재료 표). 시작하기 전에 1% Matrigel(이하 기저막 매트릭스[BMM])이 포함된 DMEM/F12로 사전 코팅된 6웰 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다. 2mL의 BMM을 사용하여 각 웰을 코팅합니다. 37 °C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. BMM, 미디어, 피펫 팁 및 피펫은 모두 BMM이 응고되는 것을 방지하기 위해 혼합하기 전에 사전 냉각해야 합니다.
   1. BMM 혼합물을 흡입합니다. 각 웰에 2mL의 실온(RT) DMEM/F12로 교체합니다.
   2. Nucleofector와 Supplement 1을 4.5:1 비율(100μL 용액에 대한 82 μL:18 μL의 Nucleofector/Supplement 비율)으로 결합합니다. 원하는 각 transfection에 대해 100μL의 Nucleofector가 필요합니다.
   3. 소용돌이 DNA. 그런 다음 각 transfection에 대해 1mL 마이크로 원심분리 튜브에 1-5μg의 DNA(처리당)를 추가합니다.
   4. 아쿠스타아제를 사용하여 건강한 ReN-GA 세포 한 접시를 수확하십시오.
      참고: 100mm 조직 배양 접시의 팽창 매체(표 1)에 있는 플레이트 세포를 만들고 포화도가 70-80%에 도달할 때까지 기다립니다.
      1. 기존 배지를 흡입하고 PBS 10mL로 한 번 세척합니다.
      2. 1mL의 아쿠타아제를 세포에 직접 첨가하고 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
      3. 접시 옆면을 부드럽게 두드려 접시에서 세포를 제거합니다. 현미경으로 세포가 느슨해지고 자유롭게 흐르는지 확인하십시오.
      4. 10mL의 DMEM/F12로 아쿠타아제를 중화하고 깨끗한 15mL 튜브로 옮깁니다.
      5. 274 x g 에서 필요한 수의 세포를 5분 동안 원심분리하고 상등액을 흡인하여 죽은 세포를 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 10mL의 DMEM/F12에 재현탁합니다.
   5. 밀도를 결정하기 위해 세포를 세십시오.
      참고: 이 연구에서는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산했습니다. electroporation 당, 3-5 x 10⁶ 개의 세포는 필요합니다 (예를들면, 5개의 처리는 15-25 x 10⁶ 개의 세포를 필요로 할 것입니다).
      1. 부유 세포 10μL를 취하여 세포 계수 챔버의 A면에 추가합니다. 그런 다음 B면에 10μL를 추가합니다.
         참고: 피펫을 옆으로 비스듬히 기울여 세포 현탁액을 추가합니다. 피펫의 플런저에 있는 첫 번째 정지 지점을 지나치지 않도록 하여 기포를 피하십시오.
      2. 채워진 계수실을 셀 카운터로 가져가 A면을 전면의 메인 슬롯에 삽입합니다.
      3. Measure( 측정)를 누른 후 mL당 세포 수를 기록해 둡니다.
      4. 챔버를 꺼내고 B면으로 뒤집은 다음 1.1.5.2-1.1.5.3 단계를 반복합니다.
      5. 이 두 숫자를 더한 다음 4로 나눈 다음(Trypan Blue를 사용하지 않는 경우) 세포가 현탁되어 있는 액체 밀리리터를 곱하여 현탁액의 총 세포 수를 구합니다.
   6. 274 x g 에서 필요한 수의 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
   7. 전기천공법당 100μL의 Nucleofector 혼합물에 펠릿을 재현탁합니다. (예: 5회 처리시 500μL).
      참고: Nucleofector 용액에 세포를 15분 이상 방치하면 세포 생존율과 전반적인 효능이 감소할 수 있습니다.
   8. DNA가 포함된 튜브 중 하나에 100μL의 세포 현탁액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
   9. DNA 혼합물을 전기천공법 큐벳에 옮기고 제공된 뚜껑으로 밀봉합니다. 기포가 생기지 않도록 큐벳을 아래쪽으로 기울이고 천천히 피펫팅하십시오.
   10. 사용 중인 장치에 적합한 Nucleofector 프로그램을 선택합니다. 이 연구에 사용된 장치의 경우 transfection을 위해 프로그램 A-033 을 사용합니다. 최적화하려면 5개의 Nucleofector 프로그램을 모두 시도하여 각 세포 유형에 가장 적합한 프로그램을 결정하십시오.
       참고: 성공적인 전기천공법의 확인은 혼합물 상단에 보이는 거품입니다.
   11. 즉시 제공된 멸균 피펫을 사용하여 사전 충진된 6웰 플레이트에서 ~500μL의 DMEM을 큐벳에 추가합니다. 한 번 부드럽게 혼합한 다음 전기천공된 세포와 배지를 해당 웰로 옮깁니다.
       참고: electroporation 후에는 세포가 매우 민감하므로 배지를 신속하게 옮기고 조심스럽게 피펫팅하는 것이 필수적입니다.
   12. 나머지 모든 DNA 처리에 대해 1.1.8-1.1.11 단계를 반복합니다.
   13. CO₂ (5%)가 있는 상태에서 37°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
   14. 다음 날, 배지를 새로운 분화 배지(표 2)와 교환하고 세포가 10일 동안 분화하도록 합니다. 2-3일마다 새 배지로 교체하십시오.

2. 라이브 셀 이미징

1. 생세포 현미경 검사를 위한 세포 준비(30분)
   1. 살아있는 세포 챔버 준비(세포를 챔버로 이동시키기 전)
   2. CO₂ 탱크와 가습기가 챔버에 연결되어 있고 밸브가 열려 있으며 탱크가 채워져 있는지 확인하십시오.
   3. 온도를 37°C, CO₂ 를 5%, 습도를 95%로 설정합니다. (수준이 평형을 이루는 데 다소 시간이 걸릴 수 있습니다.)
   4. 세포가 들어 있는 6웰 플레이트를 챔버에 놓고 세포가 보일 때까지 현미경의 초점을 조정합니다.
   5. 레이저(재료 표)를 켭니다.
   6. RFP 신호를 캡처하려면 594nm 레이저를 사용하여 형광단을 여기하고 570-640nm 방출을 사용합니다. GFP의 경우 여기 및 510-540nm 방출을 위해 488nm 레이저를 사용합니다.
   7. 내장된 형광 필터를 사용하여 배경 신호가 사라질 때까지 신호 강도를 조정합니다(거의 검은색이어야 함).
2. 축삭돌기의 실시간 비디오 캡처(총 10시간-15시간)
   참고: Nikon C2 Eclipse Ti2 도립 컨포칼 현미경은 NIS Element AR 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 512 픽셀의 해상도에서 60배 확대를 사용하여 초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 3분 동안 더 깨끗한 키모그래프를 생성합니다.
   1. RFP 바이오센서를 발현하는 세포를 찾습니다. 비디오를 촬영하기 전에 나중에 참조할 수 있도록 셀의 이미지를 내보냅니다.
   2. 축삭 주위에 맞게 스캔 영역을 자릅니다. 더 작은 스캐닝 영역을 사용하면 현미경의 처리 시간이 줄어들고 카이모그래피 생성이 훨씬 쉬워집니다.
   3. 소프트웨어가 보다 원활하게 실행될 수 있도록 모든 레이저를 끄십시오. 모든 레이저가 활성화된 상태에서 프로그램을 실행하면 모든 프레임이 캡처되지 않습니다.
      알림: 소마의 적색 형광 신호는 축삭돌기보다 훨씬 밝습니다. 따라서 축삭돌기의 전체 신호 강도를 증가시키기 위해 소마를 제외합니다. 시간 측정 탭으로 이동합니다.
   4. 간격을 초당 1프레임으로 설정하고 전체 시간을 181초로 설정합니다.
   5. 실행을 클릭합니다.
   6. 이 파일을 .nds 파일(적절하게 레이블이 지정됨)로 저장하고 MAM 안정기(MAM 1X 또는 MAM 9X)당 ~10번 프로세스를 반복합니다.
      알림: 레이저의 강도는 너무 오래 스캔하면 RFP 신호에 눈에 띄는 표백 효과를 생성하는 경우가 있습니다. 비디오를 캡처하기 위해 빠르게 작업하는 것이 중요합니다.

3. 후처리(7일)

참고: 전송을 분석하고 카이모그래프를 생성하기 위해 Fiji ImageJ 매크로가 사용되었습니다. 0.1mm/s 미만으로 움직이는 소포는 정지된 것으로 분류되었습니다. 입자 이동 빈도는 주어진 방향으로 이동하는 입자의 수(전행성, 역행) 또는 움직이지 않는 입자(정지)를 카이모그래프에서 분석된 총 입자 수로 나누어 계산했습니다. 각 소포가 일시 중지되거나 이동하는 데 소요된 시간은 분석된 각 뉴런의 모든 소포에 대해 각 조건에서 보낸 시간의 백분율을 평균하여 계산했습니다. 속도 및 실행 길이에 대한 빈도 분포는 각 실험 조건에 대해 움직이는 소포만 사용하여 계산되었습니다. 분석은 100mm 축삭 돌기에서 3분 동안 수행되었습니다.

1. 카이모그래프 생성
   1. Fiji ImageJ에서 .nds 파일을 엽니다.
   2. 이미지 탭으로 이동하여 속성을 클릭합니다. 픽셀 대 미크론 비율을 기록합니다. 이는 나중에 계산하는 데 필요합니다.
   3. 파일 > Tiff> 다른 이름으로 저장을 클릭하여 파일을 해당 폴더에 .tiff로 저장합니다(매크로는 생성된 모든 항목을 이 폴더에 자동으로 저장합니다).
   4. Kymo 매크로를 ImageJ로 드래그합니다. 코드는 Supplementary Coding File 1에 제공됩니다. 실행을 클릭합니다.
   5. 확인을 누르지 마십시오. MAX_raw 창으로 전환합니다. 축삭을 따라 수동으로 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 두 번 클릭하여 추적을 종료합니다.
      알림: 축삭 말단과 같은 축삭돌기에서 축삭을 추적해야 합니다. 이렇게 하면 전행성 및 역행 계산이 정확해집니다.
   6. ROI 관리자에서 T 명령 또는 추가를 누릅니다.
   7. 이제 확인을 클릭합니다. 이전에 만든 폴더에 카이모그래프가 생성됩니다. (X축은 미크론 단위의 축삭 길이이고 Y축은 시간 (초)입니다.)
2. 카이모그래프 추적
   1. 카이모그래프를 Fiji Image J로 드래그합니다(이전에 만든 폴더에 자동으로 배치되어야 함).
   2. 트랙 매크로를 이미지 J로 드래그합니다.
   3. 다음 프롬프트에서 확인을 클릭합니다. 이전에서 작업을 재개하는 경우 계속할 숫자 포인트를 입력하고 OK를 누릅니다.
   4. 선택 패널의 사각형 도구를 사용하여 높이가 60픽셀이고 항상 너비가 100μm인 카이모그래프의 중간 근처 영역을 선택합니다. 이렇게하려면 100을 3.1.2 단계에서 기록 된 픽셀 대 마이크로 비율로 나눕니다.
   5. 영역을 선택한 후 Ctrl T 를 눌러 ROI에 i를 추가하고 ROI를 작업 중인 폴더에 저장합니다(ROI 메뉴에서 More를 누른 다음 Save를 누름).
      참고: Ctrl+Shift+I 를 눌러 선택한 영역을 반전하면 추적하기가 더 쉬워집니다.
   6. 개별 소포의 움직임을 추적하려면 Ctrl 키를 누른 상태에서 위에서 아래로 마우스 왼쪽 버튼을 클릭합니다.
   7. 완료하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하는 동안 Ctrl 을 누르고 있으면 축삭이 추적되는 위치를 보여주는 창이 나타납니다. 문제가 없어 보이면 확인을 누릅니다.
   8. 계속하여 다른 소포를 선택하려면 예를 클릭하고 3.2.6-3.2.8단계부터 프로세스를 반복합니다. 보이는 모든 소포를 추적했으면 No를 누릅니다. 이렇게 하면 손으로 추적한 오버레이가 동일한 폴더에 자동으로 저장됩니다.
3. 카이모그래프 데이터 측정
   1. 새 폴더를 만듭니다. 생성된 모든 텍스트 파일을 폴더로 드래그합니다.
   2. kymograph 파일을 열고 치수를 기록합니다.
   3. Measure 매크로를 이미지 J로 끌어옵니다.
   4. 이전에 기록된 미크론 대 픽셀 비율을 PixelScale에 입력합니다.
   5. 속도 제한을 0.1로 낮게 변경합니다. (이 한계 이하로 이동하는 소포는 정지된 것으로 간주됩니다.)
   6. 이전에 기록된 카이모그래프 치수를 입력합니다. 요약 파일은 생성된 텍스트 폴더에 자동으로 생성됩니다. 각 요약 채우기에는 %Time Traveled, 전체 속도(μm/s), 총 거리, 평균 세그먼트 이동, 중지 횟수 및 역방향 횟수가 포함됩니다. 카이모그래프 데이터를 생성, 추적 및 측정하기 위한 코드는 Supplementary Coding File 1로 제공됩니다.

적어도 500nm 길이의 각 ReN GA(AD) 또는 ReN(나이브) 뉴런의 가장 긴 뉴런 돌기에서 각각 MAM 1X 또는 MAM 9X에 의해 안정화된 밀착(6nm ± 1nm) 또는 느슨한(24nm ± 3nm) 접촉 폭의 Mito-RFP 또는 ER 결합 미토콘드리아로 표지된 유리 미토콘드리아의 운동성을 측정하기 위해 라이브 셀 이미징 및 키모그래피 분석을 수행했습니다. 이것을 축삭돌기로 간주합니다(그림 1

시그마-1 수용체(S1R)의 억제는 뉴런 과정에서 MAM 안정화를 하향 조절하고 축삭돌기에서 Aβ 생성을 극적으로 감소(~90%)시켰지만 아밀로이드 전구 단백질[APP] 유전자(ReN GA)에서 가족성 AD[FAD] 돌연변이를 발현하는 인간 신경전구세포(ReN) 세포의 3차원(3D) 배양 시스템의 체세포에서는 감소하지 않았습니다^.23,24,25,27

RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X 및 MAM 18X를 인코딩하는 발현 플라스미드를 아낌없이 제공해 주신 필라델피아 토마스 제퍼슨 대학의 György Hajnóczky 교수님께 감사드립니다. 카이모그래프 데이터를 생성, 추적 및 측정하기 위한 코드를 작성하는 데 도움을 주신 Brigham and Women's Hospital의 선임 이미징 과학자인 Lai Ding 박사에게 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 RB에 대한 Cure Alzheimer's Fund 및 NIH의 지원을 받았으며 RET에 5R01NS045860-20을 지원했습니다.