표적 치료제의 효능을 예측하기 위한 전임상 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양 모델

프로토콜의 목표는 이 접근 방식을 사용하여 1) 면역억제 위종양 미세환경의 역할을 이해하고 2) 환자 반응의 효능을 예측하여 환자의 생존율을 높이는 것입니다.

프로그램된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)을 발현하는 종양은 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)과 상호 작용하여 면역 감시를 회피하여 CTL 증식, 생존 및 효과기 기능을 억제하고 결과적으로 암 지속성을 유발합니다. 위암의 약 40%가 PD-L1을 발현하지만 면역요법에 대한 반응률은 30%에 불과합니다. 암 환자의 결과를 개선하기 위한 표적 치료의 효능을 예측할 수 있는 전임상 모델로 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양의 사용을 제시합니다. 암 오가노이드와 면역 세포의 공동 배양이 보고되었지만, 이 공동 배양 접근법은 종양 항원을 사용하여 항원 제시 수지상 세포에 펄스를 가합니다. 그런 다음 수지상 세포(DC)를 환자의 CD8+ T 세포와 함께 배양하여 공동 배양 전에 이러한 T 림프구의 세포 용해 활성과 증식을 확장합니다. 또한, 배양에서 골수성 억제 세포(MDSC)의 분화 및 면역억제 기능이 이 공동 배양 시스템 내에서 조사됩니다. 이 오가노이드 접근법은 췌장암을 포함한 다른 암에서 치료 효능 및 환자 결과를 예측하는 데 광범위한 관심을 가질 수 있으며 적절할 수 있습니다.

위암은 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암입니다 ¹. 헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori, H. pylori)의 효과적인 진단과 치료로 인해 미국에서 위암 발병률이 낮아지고 있다 ². 그러나 이러한 악성 종양 진단을 받은 환자의 5년 생존율은 29%에 불과하여 위암은 중요한 의학적 과제가 되고 있다³. 여기에 제시된 방법의 목적은 개별 환자의 면역요법 반응을 정확하게 예측할 수 있는 접근 방식을 개발하는 것입니다. 고형 종양은 암세포와 대식세포, 골수성 억제 세포(MDSC) 및 림프구를 포함한 다양한 유형의 기질 세포, 내피 세포 및 조혈 세포로 구성됩니다(^4,5에서 검토). 암 줄기세포와 종양 미세환경(TME) 간의 상호 작용은 종양의 특성과 치료에 대한 환자의 반응에 상당한 영향을 미칩니다. 이 접근 방식은 연구자가 위암의 맞춤형 치료를 위한 전임상 약물 개발 및 바이오마커 발견에 대한 지식을 습득할 수 있도록 노력합니다.

여기에 제시된 방법은 MDSC의 면역억제 역할을 이해하기 위해 위암 환자에서 생성된 인간 유래 자가 오가노이드/면역 세포 공동 배양을 사용합니다. 제시된 것은 환자의 생존을 개선하기 위한 표적 치료의 효능을 예측할 수 있는 전임상 모델입니다. 암 오가노이드와 면역 세포의 공동 배양은 췌장암 분야에서 광범위하게 보고되었습니다 ^6,7,8,9,10. 그러나 이러한 공동 배양은 위암을 연구하기 위해 보고되지 않았습니다. 전반적으로 이 방법은 암 오가노이드와 동일한 매트릭스 환경 내에서 자가 인간 유래 면역 세포의 공동 배양을 입증하여 면역 세포가 표적 오가노이드와 접촉할 수 있도록 합니다.

Tiriac 등^[10 ]의 연구에서는 표준 치료 화학요법에 이질적인 반응을 보인 환자 유래 췌장암 오가노이드를 화학요법에 대한 환자의 반응 개선을 예측할 수 있는 화학민감성의 오가노이드 기반 유전자 발현 서명으로 그룹화할 수 있다고 보고했습니다. 연구자들은 췌장암 오가노이드의 분자 및 치료 프로파일링을 결합하면 임상 반응을 예측할 수 있다고 제안했다¹⁰. Yao 등¹¹ 의 공동 임상시험 데이터에서도 직장암 유래 오가노이드가 화학방사선 치료에 반응하여 환자의 종양 조직과 유사한 병태생리학 및 유전적 변화를 나타내는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드 배양을 치료의 예측 모델로 사용할 때 환자의 면역 세포 및 종양 면역 표현형의 맥락에서 오가노이드 배양을 사용하는 것이 기본입니다.

PD-1과 상호 작용하는 PD-L1을 발현하는 종양은 CD8+ 세포독성 T 림프구 증식, 생존 및 효과기 기능을 억제합니다 12,13,14. 위암의 약 40%가 PD-L1을 발현하지만, 이 환자들 중 30%만이 면역요법에 반응한다 15,16,17. 항 PD1 항체는 위암 치료를 위한 임상 시험에 사용됩니다 18,19,20. 그러나 현재 각 환자에 대한 치료 효능을 테스트할 수 있는 전임상 모델은 없습니다. 환자의 면역 세포가 시스템에 포함되도록 오가노이드 배양을 최적화하면 잠재적으로 면역 요법의 효능을 개별화하여 식별할 수 있습니다.

환자 종양으로부터 인간 생검 조직을 채취하기 위한 승인을 획득하였다(1912208231R001, University of Arizona Human Subjects Protection Program; IRB 프로토콜 번호: 1099985869R001, University of Arizona Human Subjects Protection Program TARGHETS).

1. 생검에서 환자 유래 위 오가노이드 확립

1. 식도 위장 내시경 검사를 받는 위암 환자의 종양 부위에서 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 1-2mm의 인체 생검 조직을 수집합니다(표 1).
   참고: 이후의 모든 절차는 멸균 재료와 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행해야 합니다.
2. 페트리 접시에 메스 칼날을 사용하여 생검된 조직을 다집니다. 다진 조직을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 5-10mL의 1x PBS를 추가합니다.
3. 실온에서 300 × g 에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 펠릿화된 조직에 1-2mL의 예열된 분해 버퍼(표 1)를 추가합니다.
4. 다진 조직의 크기에 따라 37 ° C에서 15-30 분 동안 배양하십시오. 5-10분마다 현미경 아래에서 작은 세포 클러스터를 확인하여 분해 상태를 모니터링합니다.
5. Advanced Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Ham's F-12 medium(Advanced DMEM/F-12)을 차가운 Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 medium으로 5배 희석하여 소화를 중단합니다. 소화되지 않은 물질 덩어리가 보이면 30μm 필터를 통해 조직을 걸러냅니다. 플로우 스루를 수집합니다.
6. 실온에서 300 × g 의 플로우 스루를 5분 동안 원심분리하여 셀을 펠릿화합니다. 상등액을 버리십시오.
7. 펠릿화된 세포(10,000-100,000)를 적절한 부피(2-4mL)의 해동된 기저막 매트릭스( 재료 표 참조)에 얼음 위에 재현탁합니다. 30-50 μL 세포-기저 멤브레인 매트릭스가 24웰 배양 플레이트에 떨어지면 시드가 됩니다.
8. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양하여 세포-기저 멤브레인 매트릭스 방울이 응고되도록 합니다. 세포-기저 멤브레인 매트릭스 방울을 예열된 위 오가노이드 배양 배지로 오버레이합니다(표 1).
9. 오가노이드 배양을 37°C에서 5% CO₂로 유지합니다. 오가노이드 성장에 따라 3-4일마다 배양 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 오가노이드를 7-10일에 한 번씩 1:3 비율로 통과시킵니다.

2. 수술 표본에서 환자 유래 위 오가노이드 확립

1. 항생제가 보충된 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에서 수술 중 절제된 위암 환자 표본에서 인간 위암 조직을 수집합니다(표 1).
   참고: 이후의 모든 절차는 무균 환경을 유지하고 멸균 재료와 시약을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 처리해야 합니다.
2. 페트리 접시에 수술용 메스 칼날을 사용하여 절제된 조직을 다집니다. 항생제가 함유된 5-10mL의 1x DPBS로 다진 조직을 세척합니다.
3. 조직을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다진 조직에 예열된 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 스트리핑 버퍼 10mL를 추가합니다. 5-10분마다 분해 상태를 모니터링합니다. 37°C 셰이커에서 튜브를 10분 동안 배양합니다.
4. 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 조직을 방해하지 않고 EDTA 완충액을 제거한 다음 10mL의 새로운 EDTA 완충액을 추가합니다. 튜브를 37°C 셰이커에서 5분 동안 배양합니다.
5. 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. EDTA 완충액을 제거하고 항생제(원심분리기 없음)가 보충된 고급 DMEM/F-12 10mL로 조직을 두 번(2.4단계 수행) 세척합니다(표 1).
6. 조직 크기에 따라 5-10mL의 예열된 소화 완충액(표 1)을 조직에 추가합니다. 37 °C에서 15-30분 동안 튜브를 배양하고 조직의 크기와 질감에 따라 약한 교반으로 배양합니다. 10분마다 현미경으로 세포 클러스터가 나타나는지 확인합니다.
7. 차가운 Advanced DMEM/F-12와 항생제로 2배 희석하여 소화를 중단합니다. 40μm 필터를 통해 소화되지 않은 조직을 여과하고 관류를 수집합니다.
8. 400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 플로우 스루를 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 버리고 차가운 1x DPBS와 항생제로 400 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 씻습니다. 상등액을 조심스럽게 버리고 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
9. 펠릿화된 세포를 얼음 위의 적절한 부피의 기저막 매트릭스에 재현탁시킵니다. 시드 30-50 μL 세포-기저 멤브레인 매트릭스는 24웰 또는 12웰 세포 배양 처리된 플레이트에 드롭됩니다.
10. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양하여 세포-기저 막 매트릭스 방울이 돔으로 응고될 수 있도록 합니다. cell-basement membrane matrix dome을 예열된 위 오가노이드 배양 배지로 덮습니다(표 1).
11. 오가노이드 배양을 37°C에서 5% CO₂로 유지합니다. 오가노이드 성장에 따라 3-4일마다 배양 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 오가노이드 밀도에 따라 7-10일에 한 번씩 1:2 또는 1:3 비율로 오가노이드를 통과시킵니다.

3. 오가노이드 배양의 유지 및 확장

참고 : 모든 절차는 무균 물질과 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행되어야 합니다.

1. 유지 관리 및 확장
   1. 오가노이드 배양액이 70-80% 융합될 때까지 7-10일 동안 유지합니다. 얼음처럼 차가운 DMEM에서 오가노이드를 수확합니다. 오가노이드를 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
   2. 오가노이드를 400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿 세포를 만듭니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 예열된 세포 해리 시약 용액 1mL에 펠릿을 재현탁합니다. 오가노이드를 37°C에서 6분 동안 배양합니다.
   3. 오가노이드를 26G 바늘에 4회 부드럽게 통과시킵니다. DMEM 2mL를 첨가하여 세포 해리 시약의 작용을 중지합니다.
   4. 오가노이드를 400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
   5. 펠릿화된 세포를 얼음 위의 적절한 부피의 기저막 매트릭스에 재현탁합니다. 세포-기저 멤브레인 매트릭스의 30-50 μL 시드를 24-well 또는 12-well 세포 배양 처리된 플레이트에 떨어뜨립니다.
   6. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양하여 세포-기저 막 매트릭스 방울이 돔으로 응고될 수 있도록 합니다. 세포-세포-기저 멤브레인 매트릭스 돔을 예열된 위 오가노이드 배양 배지로 오버레이합니다( 표 1 참조).
   7. 오가노이드 배양을 37°C에서 5% CO₂로 유지합니다. 오가노이드 성장에 따라 3-4일마다 배양 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 오가노이드 밀도에 따라 7-10일에 한 번씩 1:2 또는 1:3 비율로 오가노이드의 패시징을 반복합니다.
2. 오가노이드 유래 세포주의 확장
   1. 오가노이드가 70-80% 합류할 때 수확합니다. 플라스틱 플레이트에 부착된 세포에 위 오가노이드 배양 배지를 공급하고 세포 성장에 따라 3-4일마다 공급하여 배양을 유지합니다.
   2. 세포가 80-90% 합류점에 도달할 때 세포를 통과시킵니다.
      1. 배양 배지를 제거하고 예열된 DPBS로 플레이트를 부드럽게 세척합니다. 예열된 세포 해리 시약 1mL를 추가합니다.
      2. 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 2mL의 DMEM에서 세포를 수확합니다.
      3. 400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 위 오가노이드 배양 배지 또는 인간 위 상피 세포 배양 배지에 재현탁시킵니다(표 1).
   3. 3.2.2.3의 세포를 기저 멤브레인 매트릭스 코팅 또는 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이트합니다. 오가노이드 배양을 37°C에서 5% CO₂로 유지합니다. 세포 성장에 따라 격일로 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 세포 밀도에 따라 7-10일에 한 번씩 1:2 또는 1:3 비율로 세포의 패시징을 반복합니다.
      1. 플레이트를 기저막 매트릭스로 코팅하려면 매트릭스를 얼음-저온 세포 배양 등급의 물에 1:10 비율로 희석합니다. 셀 스프레더를 사용하여 1mL의 얼음처럼 차가운 희석 매트릭스 용액으로 플레이트를 균일하게 코팅하고 코팅된 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 남아 있는 코팅 용액을 제거하고 세포를 도금하기 직전에 생물 안전 후드 내부의 뚜껑 없이 플레이트를 30분 동안 건조시킵니다.
      2. 플레이트를 젤라틴으로 코팅하려면 1mL의 얼음처럼 차가운 젤라틴 기반 코팅 용액으로 플레이트를 균일하게 코팅합니다. 코팅된 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 남아 있는 젤라틴 용액을 제거하고 재현탁된 세포를 플레이트에 넣습니다.

4. 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 면역세포 배양

참고: 모든 절차는 멸균 재료와 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행해야 합니다.

1. PBMC 절연
   1. 전혈을 1x PBS의 동일한 부피로 희석합니다.
   2. 희석된 혈액 샘플의 총 부피에 따라 적절한 부피의 밀도 구배 매체( 재료 표 참조)를 15mL 튜브에 분배합니다.
      참고: 권장 비율은 밀도 구배 매체의 3mL와 희석된 혈액 샘플의 4mL입니다.
   3. 희석된 혈액 샘플을 밀도 구배 매체에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 400 × g 에서 30 분-1 시간 동안 브레이크없이 원심 분리기.
   4. 원심분리 후 계면의 단핵 셀을 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 단핵 세포를 3부피의 1x PBS로 희석합니다.
   5. 400 × g 에서 10분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 한 번 반복합니다.
   6. 펠릿화된 세포를 다운스트림 응용 분야에 적합한 배지에 재현탁시키거나 동결 스톡으로 동결 보존합니다.
   7. 필요한 경우 trypan blue 염료 배제 분석을 사용하여 PBMC의 수율 및 세포 생존율을 측정합니다.
2. 인간 수지상 세포의 배양
   1. 분리된 PBMC를 PBMC 배지( 재료 표 및 표 1 참조)에 재현탁하고 24웰 조직 배양 플레이트에 37°C에서 5%_CO2로 1-2시간 동안 플레이트화합니다.
   2. 배양판을 단단히 두드리고 비부착성 세포가 포함된 사용한 배양 배지를 버립니다.
   3. 부착 세포에 DC 배양 배지(표 1)를 추가합니다. 3 ° C에서 37 ° C에서 5 % CO₂ 일 동안 배양을 유지하십시오. 교대로 상층액 배지를 신선한 배양 배지로 교체하십시오.
   4. 3일차에 소진된 배지를 새로운 DC 성숙 배지로 교체합니다(표 1). 5% CO₂에서 37°C에서 24시간 동안 배양물을 유지합니다.
3. 인간 세포독성 T 림프구(CTL)의 배양
   1. 1mL의 PBMC를 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
   2. 50μL의 Enrichment Cocktail( 재료 표 참조)을 PBMC에 추가합니다.실온에서 10분 동안 배양합니다.
   3. 시료에 150μL의 자성 입자(재료 표)를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 세포 분리 버퍼를 사용하여 샘플 부피를 2.5mL로 늘립니다(Table of Materials). 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 세포 분리 자석(Table of Materials)에 5분 동안 넣어 세포를 분리할 수 있도록 합니다.
   5. 농축된 세포 현탁액을 새로운 15mL 코니컬 튜브에 붓습니다. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오.
   6. 펠렛화된 세포를 CTL 배양 배지(표 1)에서 24시간 동안 37°C에서 5%_CO2로 재현탁합니다.
4. 인간 골수성 억제 세포(MDSC) 배양
   1. MDSC 배양 배지(표 1)에서 7일 동안 5% CO₂ 에서 37°C에서 PBMC를 배양하여 MDSC를 농축합니다.교일로 상층액 배지를 신선한 배양 배지로 교체합니다.
5. DC와 CTL의 공동 문화
   1. 오가노이드 배양물에서 조건화된 배지를 수집합니다.
   2. 성숙된 DC 배양액에서 배지의 50%를 부드럽게 제거하고 오가노이드 유래 컨디셔닝 배지로 교체합니다.
   3. 오가노이드 유래 조건화 배지로 DC를 5% CO₂에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   4. 느슨하게 접착되는 DC를 수확하고 300 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 제거하고, RPMI 공동 배양 배지에서 펠릿을 재현탁하고, 이 세포 현탁액을 동일한 웰에 다시 첨가합니다.
   5. 동일한 환자 라인에서 CTL을 수확하여 성숙한 DC로 전달합니다. 5% CO2에서 37°C에서 72시간 동안 DC-CTL 공동 배양(표 1)을 계속합니다.

5. 오가노이드/면역 세포 공동 배양 확립

1. 섹션 4.3에서 이전에 설명한 대로 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 DC 및 CTL의 공동 배양에서 CTL을 분리합니다.
2. CTL을 37°C에서 20분 동안 5μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE)로 배양합니다.
   참고: CFSE는 세포 분열의 유세포 분석 모니터링에 사용되는 블루 레이저 여기성 염료입니다.
3. 오가노이드를 채취하여 CFSE 표지 CTL과 혼합합니다. CTL/오가노이드 비율을 오가노이드 200개당 50,000CTL로 유지하고, 얼음 위에서 적절한 부피의 해동된 기저막 매트릭스에 오가노이드를 재현탁합니다. 25μL 세포-기저 멤브레인 매트릭스가 24웰 조직 배양 플레이트에 떨어지면 시드가 됩니다.
   참고: MDSC가 필요한 실험 조건의 경우, 파종(seeding) 전에 MDSC를 오가노이드 및 CFSE 표지 CTL과 혼합합니다. MDSC/CTL 비율은 4:1이어야 합니다.
4. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양하여 세포-기저 멤브레인 매트릭스 방울이 응고되도록 합니다.
5. 세포-기저 멤브레인 매트릭스 방울을 예열된 오가노이드 배양 배지로 오버레이합니다.
6. 분석될 때까지 오가노이드/면역 세포 공동 배양을 37°C에서 5% CO₂ 로 유지합니다.

완료되면 위 오가노이드는 일반적으로 포매 후 2-4일 이내에 웰 내에서 구체로 나타납니다(그림 1). 그림 1A 는 규칙적인 막을 보이는 번성하는 위 오가노이드 배양을 보여줍니다. 종양 오가노이드는 종종 환자 샘플에 고유한 다양한 형태를 나타냅니다. 배양에 실패하면 조밀하게 나타나거나 조직의 초기 소화에서 성장이 나타?...

우리는 궁극적으로 치료 결과와 환자 예후를 개선하기 위해 표적 치료의 효능을 예측하기 위한 전임상 모델로 사용될 수 있는 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양의 사용을 제시합니다. 암 오가노이드와 면역 세포의 공동 배양이 보고되었지만, 위암 연구를 위한 이러한 공동 배양 시스템에 대한 보고는 이번이 처음입니다. 수많은 다른 오가노이드 기반 ...

저자는 공개할 내용이 없습니다.

이 작업은 NIH(NIAID) 5U19AI11649105(PI: Weiss and Wells, 프로젝트 리더 1: Zavros) 및 NIH(NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1(PI: Zavros) 보조금의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 신시내티에 있는 소화기 질환 연구 핵심 센터의 PHS Grant P30 DK078392(Integrative Morphology Core)과 5P30CA023074 애리조나 대학교 암 센터 – 암 센터 지원 보조금(PI: Sweasy)의 일부 지원을 받았습니다. Chet Closson(신시내티 대학교 Live Microscopy Core)과 Zavros 실험실의 전 구성원인 Nina Steele 박사와 Loryn Holokai 박사의 도움에 감사드립니다. 위 오가노이드/면역 세포 공동 배양 개발을 위해 조직과 혈액 기증에 동의한 환자분들께 진심으로 감사드립니다. 그들이 연구에 기꺼이 참여하지 않았다면 이 일은 불가능했을 것입니다.