생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.

해리된 해마 신경 세포 및 신경교 세포의 배양은 높은 세포 격리와 통제된 환경을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다. 그러나, 시험관 내에서 해마 세포의 생존은 손상된다 : 대부분의 세포는 배양 첫 주 동안 죽는다. 따라서 배양에서 신경 세포의 내구성을 높이는 방법을 식별하는 것이 매우 중요합니다.

산호의 골격에서 유래 한 결정질 아라고나이트 형태의 탄산 칼슘은 신경 배양을위한 우수한 활성 매트릭스로 사용될 수 있습니다. 신경교 세포를 육성, 보호 및 활성화함으로써 산호 골격은 다른 매트릭스보다 시험관 내에서 이러한 세포의 생존과 성장을 더 잘 향상시킵니다.

이 프로토콜은 산호 매트릭스에서 해마 세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 매트릭스는 산호 골격 알갱이를 배양 접시, 플라스크 및 유리 커버 슬립에 부착하여 생성됩니다. 곡물은 세포를 미세한 3차원(3D) 환경에 도입하여 성장하고 조직과 같은 구조를 형성함으로써 세포의 환경을 개선하는 데 도움이 됩니다. 산호 골격에 의해 도입 된 3D 환경은 분쇄를 통해 세포에 최적화 될 수 있으며, 이는 신경교 세포 활동에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 특성 인 입자의 크기와 밀도 (즉, 매트릭스 거칠기)를 제어 할 수 있습니다. 또한, 곡물을 사용하면 특히 광학 현미경을 사용할 때 배양을 더 쉽게 관찰하고 분석할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜에는 시험관 내에서 신경 세포의 유지 및 기능을 개선하기 위한 도구로서 산호 매트릭스의 생성 및 최적화를 위한 절차가 포함됩니다.

해리된 신경 세포(이 경우 해마 세포)의 배양은 높은 세포 분리 및 접근성을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다 ^1,2,3. 이러한 유형의 배양은 성장 및 생존 속도, 신경 독성, 신경 돌기 성장 및 네트워킹, 시냅스 연결 및 가소성, 형태 학적 변형, 신경 돌기 조직 및 배선 등과 같이 수집 할 수있는 많은 양의 정보로 인해 신경 과학, 약물 개발 및 조직 공학에서 자주 사용됩니다.1,4,5,6,7.

배양의 중요성에도 불구하고, 배양 된 세포는 일반적으로 2 차원 단층의 유리 커버 슬립에서 자라도록 강요됩니다. 이러한 엄격한 환경 변형은 시간이 지남에 따라 신경 세포의 생존 능력을 크게 감소시키는데, 이는 유리 커버슬립이 접착 강도가 낮고 세포 성장을 지원하는 능력이 낮기 때문입니다 8,9,10,11.

배양된 신경 세포는 어려운 조건에서 성장해야 하기 때문에 생존을 향상시키기 위한 필수적인 접근 방식은 가능한 한 자연 환경을 모방하는 것입니다^12,13. 이것은 매트릭스 역할을 하고 세포의 세포외 기질을 모방하여 조직과 같은 구조를 형성하고 영양을 공급할 수 있도록 하는 생체 재료를 사용하여 달성할 수 있습니다¹⁴.

생체 재료의 사용은 생체 적합성 스캐폴드의 역할을 하고 기계적 안정성을 제공하며 접착, 생존, 증식, 이동, 형태 형성 및 분화를 포함한 다양한 세포 특성을 향상시키기 때문에 세포 배양을 개선하는 유망한 접근 방식입니다^15,16,17. 시험관 내에서 세포의 상태를 개선하기 위해 여러 유형의 생체 재료가 사용됩니다. 그 중에는 생체 고분자 또는 일반적으로 세포의 세포 외 기질의 일부인 생물학적 성분이 있습니다. 이러한 생체 재료는 주로 중합 코팅제 또는 하이드로겔의 형태로 사용된다^(18,19,20). 한편, 위에서 언급한 매트릭스는 세포가 성장할 수 있는 친숙한 3D 환경을 제공하고, 접시에 대한 접착을 촉진하며, 기계적 지지를 제공합니다^(21,22). 반면에, 이들의 중합 된 형태와 하이드로 겔 내 세포의 감금은 성장 배지에 존재하는 육성 성분에 대한 세포의 접근을 방해하고 또한 미세한 방법에 의한 세포의 후속 조치를 더 어렵게 만든다²³.

산호 외골격은 생물학적 해양 기원 매트릭스입니다. 탄산칼슘으로 만들어졌으며 기계적 안정성이 있으며 생분해성이 있습니다. 산호 골격을 배양에서 성장하는 신경 세포의 매트릭스로 사용한 이전 연구에서는 유리 커버 슬립에 비해 훨씬 더 큰 접착력을 보여주었습니다^24,25. 또한, 산호 골격에서 자란 신경 세포는 골격을 구성하는 칼슘을 섭취하는 능력을 입증했으며, 이는 영양 결핍 상태에서 신경 세포를 보호한다²⁶. 또한, 산호 골격은 신경 세포의 생존을 증가시키고, 신경망의 형성을 촉진하고, 시냅스 연결의 속도를 높이고, 조직과 같은 구조의 형성을 가능하게하는지지 및 양육 매트릭스입니다^27,28. 최근 연구에 따르면 산호 골격 매트릭스의 표면 지형은 신경교 세포의 분포와 활성화에 중요한 역할을 합니다 ^8,29. 또한, 산호 골격은 배양에서 골세포^30,31, 간세포 및 심근 세포와 같은 다른 세포 유형의 배양을위한 매트릭스로서 효과적이다 (미공개 데이터).

따라서 산호 골격은 시험관 내에서 세포 배양을위한 유망한 매트릭스입니다. 따라서 아래에 자세히 설명 된 프로토콜은 기존 방법으로 달성 한 것보다 더 안정적이고 번영하는 신경 배양을 생산하기 위해 산호 골격에서 신경 세포를 배양하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 심근 세포, 간세포 및 다른 세포 유형의 배양에 유용 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 국가 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 탄산칼슘 산호 골격은 아라고나이트의 결정 형태로 사용해야 합니다. 지금까지 신경 배양에 대해 테스트 된 산호 유형은 Porites Lutea, Stylophora Pistillata 및 Trachyphyllia Geoffroyi입니다. 해골은 전체 또는 지상으로 구입할 수 있습니다.

1. 산호 골격 조각 청소

주의 : 아래 설명된 용액은 위험하고 화상과 자극을 유발할 수 있으므로 실온의 화학 후드에서 다음 단계를 수행해야 합니다.

1. 망치를 사용하여 산호 골격을 부수고 0.5-2cm 조각으로 나눕니다. 유기 및 비 유기 잔류 물을 용해시키기 위해 산호 골격 조각을 10 % 차아 염소산 나트륨 용액에 10 분 동안 담근 다음 이중 증류수 (DDW)로 한 번 씻으십시오.
2. 남아있는 유기 잔류 물을 제거하려면 1M NaOH 용액에 5 분 동안 담근 다음 DDW로 한 번 씻으십시오. 단편을 30%_H2O2용액에 10분 동안 담궈 유기 침전물의 제거를 계속한 다음, 단편을 DDW로 3x 세척한다.
3. 가능한 한 많은 DDW를 제거하고 후드의 산호 조각을 건조시킵니다 (1-8 시간).

2. 유리 커버슬립 청소

1. 유리 커버슬립을 100mm 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 95% 에탄올 10mL를 15분 동안 넣습니다.
2. 에탄올을 제거하고 DDW 3x로 세척하고 각 세척 사이에 10 분을 기다립니다. DDW가 증발할 때까지 80°C로 예열된 가열판에 접시를 놓습니다. 건조하는 동안 플레이트 안의 커버슬립이 서로 달라붙지 않도록 여러 번 부드럽게 저어줍니다.
3. 커버슬립을 오토클레이브합니다.

3. 산호 골격 알갱이의 제조

1. 산호 골격 조각을 박격포와 유봉 (수동 분쇄)을 사용하여 완전히 분해 될 때까지 분쇄하십시오. 결과는 20 μm-200 μm 범위의 입자 혼합물입니다.
2. 또는 전기 연삭기를 사용하여 30 초 동안 1,000rpm의 속도로 산호 골격 조각을 분쇄합니다 (블레이드 길이 = 6cm, 너비 = 0.5cm-1.0cm). 생성 된 입자 크기는 수동 분쇄에 의해 생성 된 크기 범위와 유사합니다.

4. 특정 크기 범위의 입자 정제

알림: 매트릭스의 입자 크기를 제어하려는 경우 다음 여과 기반 입자 정제 절차를 사용하십시오.

1. 곡물을 수동 또는 전기식 40μm 필터 메쉬 스트레이너로 옮깁니다.
2. 스트레이너를 통해 곡물을 체질하여 곡물을 두 개의 특정 범위로 나눕니다(전기 여과기를 사용하는 경우 다음 조건이 권장됩니다: 흔들림 = 600amplitudes/min, 바운싱 = 6/s). 이 절차는 입자 크기의 두 그룹, 즉 하나는 <40μm이고 두 번째는 >40μm입니다.
   알림: 두 가지 크기는 다양한 메쉬의 스트레이너를 사용하여 결정할 수 있습니다. 더 제한된 범위가 필요한 경우 4.2 단계에서 다른 메쉬를 가진 스트레이너를 통해 각 그룹을 다시 체로 만듭니다.
3. 곡물을 고압 증기 멸균하십시오.

5. 산호 곡물 코팅 접시 또는 커버 슬립의 준비

1. 플라스크, 접시 또는 페트리 접시 코팅용
   알림: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
   1. 행크스 용액에 용해 된 20 μg / mL 폴리 -D- 라이신 (PDL) 용액에 산호 골격 알갱이를 첨가합니다. 권장 농도는 PDL 용액 1mL당 곡물 5mg/10mg입니다.
   2. 용액을 플라스크와 접시(약 2mL/25cm2)에 붓고 4°C에서 밤새 배양합니다. 곡물은 가라 앉고 바닥에 붙어 있습니다.
   3. 다음날, 플라스크와 접시를 멸균 DDW로 한 번 씻으십시오. 플라스크와 접시를 후드에서 말리십시오.
      알림: 갓 코팅된 플라스크와 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 코팅된 플라스크 및 접시는 4°C에서 보존하면 코팅 후 최대 일주일까지 사용할 수 있습니다. 그러나 매트릭스의 효율성이 저하 될 수 있습니다.
2. 코팅 유리 커버슬립(직경 12mm, 두께 0.17mm)
   1. 원하는 농도로 DDW에 산호 골격 알갱이를 추가하십시오. 신경 세포에 사용되는 일반적인 밀도는 5mg/mL 및 10mg/mL입니다. 40μL의 곡물 용액을 커버슬립 중앙에 붓습니다(그림 4).
   2. 80°C로 예열된 가열판에 커버슬립을 놓고 완전히 증발할 때까지 기다립니다(보통 15분). 이러한 조건 하에서, 곡물은 커버 슬립에 부착됩니다. 코팅된 커버슬립을 오토클레이브합니다. 멸균 상태에서 보관하십시오.
   3. 배양 하루 전, 멸균 된 24 웰 플레이트의 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 각 커버슬립에 20μg/mL PDL 용액 100μL를 추가합니다. 팁을 사용하여 액체가 전체 입자 영역과 나머지 커버슬립 표면을 덮도록 합니다.
   4. 접시 바닥으로 뚜껑을 덮으십시오. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 감 쌉니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   5. 다음날 DDW로 한 번 씻고 후드에서 말립니다.
      알림: 갓 코팅된 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다.

6. 산호 골격 곡물 코팅 유리 커버 슬립에서 해마 해리 세포의 배양

참고: 해마 해리 세포 배양 방법은 이전에 발표된 절차^24,27에서 수정되었습니다. 배양 물의 준비는 4 마리의 쥐 새끼에 대해 설명된다. 각 해마의 예상 수율은 1-1.5 x 10⁶ 세포입니다.

1. 설치
   1. 빈 60mm 페트리 접시를 준비합니다. 최소 필수 배지(MEM) 2mL를 60mm 페트리 접시에 붓고 얼음 위에 올려 놓습니다.
   2. MEM 2mL를 35mm 접시에 붓고 37°C, 5–10%_CO2의 인큐베이터에 넣습니다. 2mL의 MEM을 15mL 튜브에 붓고 4°C에서 유지합니다.
   3. First Day Medium 1mL를 15mL 튜브에 붓고 37°C, 5-10%_CO2의 인큐베이터에 넣는다.
      참고: First Day Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.
   4. 2.5% 트립신 용액 200μL를 해동하고 37°C에서 배양합니다.
   5. 화염을 사용하여 직경 0.5mm, 0.75mm 및 1.0mm 헤드가 있는 유리 파스퇴르 피펫 3개를 준비합니다.
   6. 적절한 수술 도구를 준비하십시오 : 큰 가위 1 개, 작은 가위 2 개, 큰 핀셋 1 개, 작은 핀셋 4 개, 메스 1 개.
   7. 후드에 실체 현미경을 준비하십시오.
2. 큰 가위를 사용하여 0-3일 된 Sprague Dawley 쥐 새끼의 머리를 몸에서 분리하여 빈 60mm 페트리 접시에 넣어 희생합니다(6.1.1단계). 시체를 처리하십시오.
3. 큰 핀셋으로 입에서 머리를 잡고 들어 올리십시오. 작은 가위로 두개골을 덮고있는 피부를 자릅니다.
4. 깨끗한 가위로 두개골 아래(소뇌 측면)로 들어가 두개골을 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 제거할 수 있도록 합니다. 작은 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 떼어냅니다.
5. 깨끗한 핀셋으로 뇌를 머리에서 분리하고 60mL의 차가운 MEM이 들어 있는 2mm 페트리 접시에 넣습니다(6.1.2단계 참조).
6. 두 개의 작은 핀셋을 사용하여 실체 현미경으로 해마를 해부합니다. 해마를 MEM이 들어있는 준비된 35mm 접시 (6.1.2 단계)에 옮깁니다.
   알림: 각 강아지에 대해 6.3–6.6단계를 반복해야 합니다.
7. 메스를 사용하여 해마를 약 1mm 조각으로 자릅니다. 트립신 용액 200 μL를 첨가한다 (0.25%의 최종 농도로 희석한다). 부드럽게 혼합하고 37 °C, 5–10 % CO₂ 에서 30 분 동안 배양합니다.
8. 배양 후 2mL의 차가운 MEM(단계 6.1.2)을 접시에 넣어 트립신을 비활성화합니다. 트립신화된 조직을 37°C로 예열된 1 mL First Day Medium이 들어있는 15 mL 튜브로 옮기고(단계 6.1.3) 가장 큰 직경을 갖는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다(단계 6.1.5).
   참고: 조직의 추가 처리를 위한 최상의 배지 대 조직(v:v) 비율은 1mL/8 해마입니다. 가능한 한 조직과 함께 배지를 옮기지 마십시오.
9. 조직을 가장 큰 직경의 유리 피펫에 10-15 번 통과시켜 분쇄하십시오. 그런 다음 중간 직경의 유리 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다. 가장 작은 직경의 파이펫으로 연삭을 계속하십시오. 세포 사멸을 줄이기 위해 버블링을 피하십시오.
10. 나머지 조직 조각을 2-5분 동안 가라앉힌 다음 상층액을 다른 15mL 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
    참고: 바람직한 세포 밀도는 200,000–400,000 cells/mL입니다. First Day Medium을 사용하여 희석하거나 470 x g 에서 원심분리하여 세포를 농축합니다.
11. 각 유리 커버슬립에 100μL의 세포를 시드합니다. 씨를 뿌리는 동안 전체 커버 슬립을 세포로 덮으십시오. 37 °C, 5–10%_CO2에서 배양합니다.
12. 다음날, 500 μL의 뉴런 성장 배지를 웰에 첨가한다.
    참고: Neuronal Growth Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.
13. 커버슬립을 기울여 First Day Medium을 제거하면서 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 적절한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 뚜껑에서 남은 매체를 흡입합니다.
14. 37 °C, 5–10%_CO2 에서 배양합니다. 배양하는 동안 배지를 교체하지 마십시오. 배양 물은 이러한 조건 하에서 최대 1 개월까지 유지 될 수 있습니다. 주요 관심사는 습도입니다. 따라서 인큐베이터를 최대한 가습 상태로 유지하십시오.

산호 골격 매트릭스를 준비하기 위해 전체 산호 골격 (그림 1A)을 망치 (그림 1B)를 사용하여 0.5-2cm 조각으로 나누고 10 % 차아 염소산염 용액, 1M NaOH 용액 및 30 % H 2 O₂용액 (그림 1C)을 사용하여 3 단계 (프로토콜의 1 단계)를 통해 유기 잔류 물로부터 철저히 세척했습니다. 산호 조각은 골격 색이 갈색 (?...

여기에 제시된 기술은 배양에서 신경 세포의 유지 및 기능을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이것은 세포를 키우고 성장과 활동을 촉진하는 산호 골격 알갱이로 만들어진 매트릭스에 세포를 부착함으로써 달성됩니다. 이 기술을 사용하면 뇌의 세포 환경을 모방하는 신경 배양 모델의 능력이 증가합니다.

배양 기질로서 매트릭스의 도입은 고전적인 신경 세포 배양 방법에 사?...

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 작업은 이스라엘 무역 노동부의 KAMIN 프로그램과 Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US에서 자금을 지원했습니다.