この作業では、ソフトウェアSciGlassを使用してクライオ電子線トモグラフィーデータをセグメント化するプロトコルについて説明します。SciGlassは、クライオETテレグラムをセグメント化するための没入型で直感的なインターフェースを提供するバーチャルリアリティベースのソフトウェアであり、VRがクライオETセグメンテーションパイプラインに統合できる実行可能なツールであることを示しています。Cryo-ETは、イノベーションと集中力で急速に進歩しています。
より薄いサンプルとより高速なデータ収集方法、およびセグメンテーション粒子ピッキングを改善するための機械学習アルゴリズムの使用など、これらすべての進歩は、より優れたクライオETと非常に優れた生物学的洞察の採用につながっています。Cryo-ETは、低スループットのクライオなどの課題に直面しています。500ナノメートル以上の厚さのサンプルで、コピー数が少ないために関心領域をターゲティングするのが難しい場合。
さらに、データ処理は依然としてボトルネックであり、粒子のピッキングとセグメンテーションのための広範な手動注釈と、クライオETに必要な専門知識が必要であるため、ワークフロー全体が遅くなります。バーチャルリアリティは、従来の方法と比較してセグメンテーションの効率を向上させることがわかりました。その没入型環境は、ギャップを埋め、誤検知を減らすことで自動化されたアプローチを補完します。
さらに、このVRプラットフォームはトレーニングや教育に非常に効果的であり、クライオETデータ分析の用途の広いツールとなっています。私たちのプロトコルは、手動のプロセスや遅くて難しいプロセスなど、従来のセグメンテーションの非効率性に対処しているため、バーチャルリアリティの没入型で直感的な性質を活用することで、プロセスをより速く、よりユーザーフレンドリーにすることでセグメンテーションを合理化することを目指しています。まず、生のクライオET断層撮影をSciGlassと互換性のあるデータ形式(TIFFスタックなど)に変換します。
ImageJ を使用して信号を設定し、パーティクルが黒地に白であることを確認します。[処理]、[コントラストの強化]の順に移動し、[ヒストグラムの均等化]をオンにして、すべてのスライスを処理します。コンピューターでバーチャルリアリティソフトウェアを起動します。
[ファイル]メニューに移動し、[プロジェクトの作成]を選択します。[新しいプロジェクトの作成]をクリックし、次にソフトウェアの[ファイルの追加]をクリックします。TIFF ファイルの場所に移動し、プロジェクトにインポートします。
プロンプトが表示されたら、[No.Next]をクリックした後、ファイルが時系列の一部ではないことを確認し、プロジェクトに名前を割り当てて[保存]をクリックし、プロジェクトリストの下にプロジェクトを作成します。プロジェクトをダブルクリックして断層撮影を開き、インタラクティブな仮想現実環境にロードします。バーチャルリアリティ(VR)を設定するには、VRヘッドセットとハンドコントローラーをコンピューターに接続します。
画面の指示に従って、VR環境を調整します。セグメンテーションに必要な領域がVR環境の視野内にあることを確認するようにシステムを調整し、ソフトウェアインターフェースの視覚化ボタンをクリックします。コントラスト、ウィンドウ、明るさ、しきい値スライダーなどの視覚化オプションを調整して、信号を強化し、ノイズを最小限に抑えます。
ハンドコントローラーを使用して、断層撮影を近づけたり押したりして、検査を改善します。左手のコントローラーを使用してカットツールをアクティブにします。断層撮影内のさまざまなスライスを視覚的に検査します。
断層撮影をナビゲートして、セグメンテーションが始まる目的のスライスに移動します。ハンドコントローラーを使用して、注釈メニューの下にある関心領域(ROI)オプションをアクティブにします。断層撮影に緑色のボックスが表示されます。
緑色のボックスのサイズと位置をセグメント化する領域に合わせて調整します。次に、左側のコントローラーを使用してROIをロックします。ツールはセグメンテーションのペイントモードに切り替わります。
断層撮影をズームインまたはズームアウトして、正確なセグメンテーションを実現します。時計回りまたは反時計回りに回転させて絵筆のサイズを調整し、最適な制御を実現します。ミトコンドリア膜などの関心領域を 3 次元領域内で慎重にセグメント化します。
セグメンテーションを実行しながら、ボールの半径を適切に調整してください。セカンダリコントローラートリガーを使用して消去モードを作動させ、セグメンテーションエラーを修正し、セグメンテーションと同じモーションを使用して消去します。断層撮影が完全にセグメント化されるまで、すべての領域に対してセグメンテーションプロセスを繰り返します。
セグメンテーションが完了したら、完了したプロジェクトをクリックして強調表示します。「プロジェクト」タブをクリックし、「ROI」を選択して続行します。ボリューム全体をエクスポートするか、特定の対象領域をエクスポートするかを選択し、セグメント化されたデータのエクスポート場所を指定します。
次に、エクスポートされたセグメント化されたデータをSciGlassから目的のソフトウェアにロードして分析し、セグメント化されたデータの追加分析を行います。クライオETデータを準備したら、プロジェクトを右クリックして[Add Mask Data]をクリックし、初期セグメンテーションが保存されている場所に移動して、同じプロジェクトの下にインポートします。ROI アノテーションを使用して、初期セグメンテーションを編集します。
最後に、セグメンテーションを追加または削除して、初期セグメンテーションをクリーンアップします。1ピクセルあたり16オングストロームで再構成された断層撮影の重み付け後方投影により、ノイズ除去と欠落したウェッジ補正後にミトコンドリアと膜状の構造が明らかになりました。没入型のバーチャルリアリティ環境での視覚化により、ヒストグラムの均等化によりコントラストが向上した後、膜の詳細な3D検査が可能になりました。
手動セグメンテーションでは、膜境界やROIの正確なマッピングなど、VRツールを使用して、ミトコンドリアとオルガネラの構造を高精度で描写しました。最終的な3Dレンダリングでは、外膜や内膜などの詳細なミトコンドリアの特徴が明らかになりました。そして、リン酸カルシウムは滑らかにされたメッシュで堆積します。
