私たちの研究は、好中球サブセットの役割と、それらが狼瘡などの炎症性疾患の病因にどのように寄与するかを理解することを目的としています。より広い意味では、私たちの研究は、ヒト生物学における好中球集団の不均一性と、これがさまざまな生理学的状態に基づいてどのように変化するかを示しています。新たな研究によると、ヒトの好中球集団は不均一です。
しかし、好中球は、活性化せずに十分な量でサブタイプを確実に分離することが難しいため、単一の集団として研究され続けています。私たちのプロトコルは、好中球サブタイプの手つかずの分離と基本的な特性評価の方法を提供し、これらの問題を克服します。最近の研究では、限定的ではありますが、低密度好中球などの好中球サブタイプが、妊娠や炎症などの生理状態の変化や、結核、自己免疫、がんなどの疾患に関与していることが示されています。
私たちのプロトコールは、これらの細胞が人間の健康と病気に寄与する再現性のある堅牢な研究を可能にします。低密度好中球を正常密度好中球から分離するための堅牢なプロトコルが得られたので、これらの低密度好中球が炎症状態でどのように現れるかに関する基本的な質問に答えることに焦点を当てています。特に、これらが正常密度の好中球と細胞数、免疫表現型、免疫代謝などとどのように異なるのかに興味を持っています。
まず、100%81%70%および55%の等張作業溶液用の4つの50ミリリットルの円錐管にラベルを付けます100%ラベル付けされた最初のチューブに27ミリリットルの密度勾配媒体を追加します100%10XPBSの3ミリリットルを追加します。次に、作業溶液の各濃度について、等張性100%作業溶液と1X PBSの必要量を測定します。それぞれの円錐形チューブに追加します。
パスツールピペットを使用して、均一性のために完全に混合します。次に、3ミリリットルの等張性81%ワーキング溶液を15ミリリットルの円錐管の底に慎重に重ねます。次に、等張性70%の作業溶液の3ミリリットルをゆっくりと穏やかに上に重ね、層が混ざらないようにします。
細胞分離バッファーを調製するには、2%ウシ胎児血清、1ミリモルEDTAおよびPBSを総容量500ミリリットルまで組み合わせます。均一性のために完全に混合するピペット。磁気ビーズを30秒間完全にボルテックスして、使用前に完全に再懸濁されていることを確認してください。
ドナーごとに、4ミリリットルの全血を3つの別々の14ミリリットルの丸底チューブに分注します。200マイクロリットルの好中球分離カクテルと200マイクロリットルの磁気ビーズを各チューブにピペットで移します。インキュベートする前に、溶液を静かにピペットでピペットで動かして混合物を再懸濁し、試薬が不要な細胞に結合できるようにします。
次に、各チューブに細胞分離バッファーを添加して容量を12ミリリットルにし、よく混合します。蓋のないチューブを磁気ラックに置き、インキュベートします。次に、血清ピペットを使用して、好中球を含む透明細胞懸濁液を各チューブから新しいきれいなチューブに慎重に移します。
次に、元のチューブを磁石から取り外します。磁気ビーズを再度30秒間ボルテックスします。200マイクロリットルの磁気ビーズを新たに転写した細胞懸濁液に加えてから、前に示したように再懸濁とインキュベーションを行います。
チューブを蓋なしで磁石に戻します。室温で10分間インキュベートした後、単離された好中球を含む透明細胞懸濁液を新しいチューブに移します。全血から得られた単離された好中球懸濁液を1本の50ミリリットルのチューブに引き込みます。
細胞分離バッファーを使用して、チューブを総容量50ミリリットルまで補充します。ブレークをオンにした状態で遠心分離し、上清を捨てて、好中球ペレットを1ミリリットルの細胞分離バッファーに再懸濁します。懸濁液を再度遠心分離した後、上清を捨て、好中球ペレットを55%密度勾配培地の3ミリリットルに再懸濁します。
細胞懸濁液を含む3ミリリットルの55%密度勾配培地を、あらかじめ作られた密度勾配チューブにゆっくりと重ね合わせ、勾配の乱れを避けます。ブレークを使用せずに、チューブを720Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、層を乱さないようにチューブを慎重に取り扱ってください。
トランスファーピペットを使用して、低密度と正常密度の好中球を含む別々の層を慎重に分離し、それらを別々の標識15ミリリットルチューブに移します。残留密度グラジエントメディウムを洗い流すには、各15ミリリットルチューブにPBSを15ミリリットルマークまで追加します。次に、ブレークをオンにした状態で、室温で400Gで5分間遠心分離します。
さらに実験を行う前に、血球計算盤で各画分の細胞をカウントします。密度勾配媒体上に全好中球を層状にすることで、2つの異なるバンドの形成に成功しました。低密度の好中球が上のバンドを形成し、通常の密度の好中球が下のバンドを形成します。
密度勾配培地に1ミリリットルあたり500万〜600万個の好中球を過剰に充填すると、バンドがびまん性に見え、サブタイプ混合のリスクが高まりました。平均単離純度は、低密度好中球で93.8%、正常密度好中球で96.3%であり、他の細胞タイプからの汚染は最小限でした。
