يهدف بحثنا إلى فهم دور المجموعات الفرعية للعدلات وكيف تساهم في التسبب في الأمراض الالتهابية مثل الذئبة. بمعنى أوسع ، يوضح عملنا أيضا عدم تجانس مجموعات العدلات في علم الأحياء البشري وكيف يمكن أن يتغير هذا بناء على الحالات الفسيولوجية المختلفة. تظهر الأبحاث الناشئة أن مجموعات العدلات في البشر غير متجانسة.
ومع ذلك ، لا تزال العدلات تدرس كمجموعة سكانية واحدة بسبب صعوبة عزل الأنواع الفرعية بشكل موثوق دون تنشيط وبكميات كافية. يوفر بروتوكولنا طريقة للعزل البكر والتوصيف الأساسي للأنواع الفرعية للعدلات ، والتغلب على هذه المشاكل. أظهرت الأبحاث الحديثة ، على الرغم من محدوديتها ، أن الأنواع الفرعية للعدلات ، مثل العدلات منخفضة الكثافة ، تلعب دورا في الحالات الفسيولوجية المتغيرة مثل الحمل والالتهابات وكذلك في أمراض مثل السل والمناعة الذاتية والسرطان.
سيمكن بروتوكولنا من إجراء بحث قوي وقابل للتكرار حول مساهمات هذه الخلايا في صحة الإنسان ومرضه. الآن بعد أن أصبح لدينا بروتوكول قوي تم اختباره لفصل العدلات منخفضة الكثافة عن العدلات ذات الكثافة الطبيعية ، فإننا نركز على الإجابة على الأسئلة الأساسية المتعلقة بكيفية وجود هذه العدلات منخفضة الكثافة في الظروف الالتهابية. نحن مهتمون بشكل خاص بكيفية اختلافها عن العدلات ذات الكثافة الطبيعية في أعداد الخلايا ، والنمط الظاهري المناعي ، والتمثيل الغذائي المناعي ، والمزيد.
للبدء ، قم بتسمية أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر لمحاليل العمل متساوية التوتر بنسبة 100٪ 81٪ 70٪ و 55٪ أضف 27 مل من وسط تدرج الكثافة إلى الأنبوب الأول المسمى 100٪ أضف 3 ملليلتر من 10X PBS. بعد ذلك ، قم بقياس الأحجام المطلوبة من حلول العمل متساوية التوتر بنسبة 100٪ و 1X PBS لكل تركيز من حلول العمل. أضفه إلى الأنابيب المخروطية المعنية.
استخدم ماصة باستور للخلط جيدا من أجل التجانس. الآن ضع بعناية 3 ملليلتر من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 81٪ في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ثم ضع ببطء ولطف 3 ملليلتر من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 70٪ في الأعلى ، مما يضمن عدم اختلاط الطبقات.
لتحضير المخزن المؤقت لفصل الخلايا ، امزج 2٪ من مصل الأبقار الجنينية و 1 ملليمول EDTA و PBS بحجم إجمالي يبلغ 500 ملليلتر. ماصة للخلط جيدا للتوحيد. قم بتدوير الخرزات المغناطيسية جيدا لمدة 30 ثانية للتأكد من إعادة تعليقها بالكامل قبل الاستخدام.
لكل متبرع ، قم بتقسيم 4 ملليلتر من الدم الكامل إلى ثلاثة أنابيب سفلية مستديرة منفصلة سعة 14 ملليلترا. ماصة 200 ميكرولتر من كوكتيل عزل العدلات و 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي في كل أنبوب. قم بسحب المحلول برفق لإعادة تعليق الخليط قبل الحضانة للسماح للكواشف بالارتباط بالخلايا غير المرغوب فيها.
بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت لفصل الخلايا إلى كل أنبوب لتكوين الحجم إلى 12 مل واخلطه جيدا. ضع الأنابيب بدون أغطية على رف مغناطيسي واحتضنها. استخدم الآن ماصة مصلية لنقل معلق الخلية الشفاف الذي يحتوي على عدلات بعناية من كل أنبوب إلى أنبوب نظيف جديد.
ثم قم بإزالة الأنبوب الأصلي من المغناطيس. دوامة الخرز المغناطيسي مرة أخرى لمدة 30 ثانية. أضف 200 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية إلى تعليق الخلية المنقول حديثا قبل إعادة التعليق والحضانة كما هو موضح سابقا.
ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس بدون أغطية. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، انقل معلق الخلية الشفاف الذي يحتوي على عدلات معزولة إلى أنبوب جديد. اسحب معلقات العدلات المعزولة التي تم الحصول عليها من الدم الكامل إلى أنبوب واحد سعة 50 ملليلترا.
قم بتعبئة الأنبوب إلى حجم إجمالي يبلغ 50 مل باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلية. جهاز طرد مركزي مع الكسر ، ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات العدلات في 1 مليلتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا. بعد الطرد المركزي للتعليق مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات العدلات في 3 ملليلتر من وسط التدرج الكثافة 55٪.
ضع طبقة ببطء من 3 ملليلتر من وسط التدرج الكثافة بنسبة 55٪ الذي يحتوي على تعليق الخلية على أنابيب تدرج الكثافة المعدة مسبقا ، وتجنب اضطراب التدرج. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 720 جم لمدة 30 دقيقة دون استخدام الكسر. بعد الطرد المركزي ، تعامل مع الأنابيب بعناية لتجنب إزعاج الطبقات.
باستخدام ماصة النقل ، اعزل بعناية الطبقات المنفصلة التي تحتوي على عدلات منخفضة الكثافة وعادية ونقلها إلى أنابيب منفصلة سعة 15 ملليلترا. لغسل أي وسط تدرج بكثافة متبقية ، أضف PBS إلى كل أنبوب سعة 15 مليلتر حتى علامة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الانقطاع.
عد الخلايا في كل جزء على مقياس كثافة الدم قبل إجراء مزيد من التجارب. أدت طبقات العدلات الكلية فوق وسط تدرج الكثافة إلى التكوين الناجح لشريطين متميزين. مع العدلات منخفضة الكثافة التي تشكل نطاقا علويا وتشكل العدلات ذات الكثافة الطبيعية نطاقا سفنيا.
تسبب التحميل الزائد لوسط تدرج الكثافة بالعدلات التي تزيد عن 5-6 ملايين خلية لكل مليلتر في ظهور العصابات منتشرة ، مما يزيد من خطر اختلاط النوع الفرعي. كان متوسط نقاء العزل 93.8٪ للعدلات منخفضة الكثافة ، و 96.3٪ للعدلات ذات الكثافة الطبيعية مع الحد الأدنى من التلوث من أنواع الخلايا الأخرى.
