私たちは、同じショウジョウバエの脳で複数のラウンドのin situハイブリダイゼーションを実行できる堅牢なプロトコルを開発し、多くの異なる遺伝子の発現パターンを視覚化できるようにしました。ハエの脳をハイドロゲルに埋め込むと、複数回のハイブリダイゼーションで優れた組織完全性とmRNAの安定性が保証されます。また、イメージング時の光学的明瞭さも大幅に向上します。
EASI-FISHは、ハエの脳内の細胞タイプの遺伝子発現プロファイルを定義するために、共焦点顕微鏡またはライトシート顕微鏡を備えた任意のラボで採用できます。まず、非荷電スライドをRNA除染試薬でワイプします。シリコーンガスケットから接着剤を保護している不透明なフィルムをはがします。
次に、最大4つのチャンバーを含むガスケットをスライドに接着します。P20ピペットを使用して、各チャンバー表面を1マイクロリットルのポリリジンでコーティングします。次に、チューブごとに最大4つのショウジョウバエの脳を0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。
0.1%Triton X-100を含む150マイクロリットルのPBSで脳を再水分し、続いてPBSを補充します。各チャンバーに40マイクロリットルのPBSを追加します。細いピンセットで、脳をチャンバーの中央に一列にそっと配置し、それらの間にある程度のスペースを残します。
チャンバーからPBSを取り出し、すぐに50マイクロリットルの20ミリモルMOPSバッファーを追加します。脳がMOPSバッファーで平衡化している間に、等量の融解したMelphalan-Xを等量のMOPSバッファーのチューブにピペットで入れます。次に、Ac-Xストック溶液を1対100の比率で添加します。
溶液をボルテックスし、短時間回転させて収集します。チャンバーからすべてのMOPSバッファーを取り出し、50マイクロリットルのMelphalan-X Ac-X溶液を追加します。シール用のガスケット接着剤を使用せずに、各チャンバーの上部にカバースリップを置きます。
次に、チャンバーを加湿ボックスに入れます。翌日、カバースリップを慎重に取り外し、Melphalan-X Ac-X溶液を吸引します。取り付けられた脳を0.1%PBTの100マイクロリットルで2回洗浄し、続いて100マイクロリットルのPBSで洗浄します。
TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO、TEMED、過硫酸アンモニウムの解凍液を氷の上に置きます。TREx-1000溶液をボルテックスして、沈殿物がないことを確認します。溶液を混合してゲル溶液を調製し、アイシングする前にボルテックスします。
ピペットチップを使用して、PBSをチャンバーから取り外し、糸くずの出ないワイプで残留液体を吸い取ります。すぐに各チャンバーの脳に40マイクロリットルのゲル溶液を追加します。チャンバーを摂氏4度で10分間インキュベートします。
次に、チャンバーからゲル溶液を取り出します。次に、ガスケット表面の接着剤から透明な保護フィルムをはがします。最後に45マイクロリットルの新鮮なゲル溶液を加えます。
カバースリップをチャンバーにそっと置き、カバースリップを押してチャンバーを密閉してから、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。チャンバーを摂氏37度で1.5時間インキュベートし、ゲルを重合します。ベンチでゲルを冷却した後、カミソリの刃を使用して、カバースリップとシリコンガスケットを慎重に取り外します。
ゲルを長方形にトリミングし、サンプルの向きを示すために右上隅をカットします。次に、少量のPro Kバッファーで湿らせた細い絵筆を使用して、ゲルをスライドから慎重に持ち上げます。各ゲルを2ミリリットルの微量遠心チューブに個別に移します。
500マイクロリットルのPro Kバッファーと5マイクロリットルのプロテイナーゼK酵素を混合し、各ゲルに混合物を加えます。摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細いフレキシブルピペットで緩衝液を取り出し、ゲルをPBSで3回、それぞれ10分間洗浄します。
ゲルを1ミリリットルのDNASE1緩衝液中で37°Cで30分間インキュベートします。50マイクロリットルのDNASE1酵素と450マイクロリットルのDNASE1バッファーを混合します。ボルテックスせずに穏やかに混ぜます。
各ゲルを500マイクロリットルのDNASE1溶液に37°Cで2時間インキュベートします。次に、ゲルを室温で1ミリリットルのPBSで15分間4回洗浄します。次に、500マイクロリットルの解凍ハイブリダイゼーションバッファーで、プローブなしでゲルを37°Cで30分間インキュベートします。
ハイブリダイゼーションバッファー中のプローブを1対100の比率で希釈し、ゲルあたり300マイクロリットルを調製します。プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーとゲルを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、まずプローブ洗浄バッファーでゲルを洗浄し、次にPBSで洗浄します。
ハイブリダイゼーション連鎖反応では、500マイクロリットルの増幅バッファーをゲルに加え、室温で30分間インキュベートします。蛍光ヘアピンをPCRマシンで摂氏95度で90秒間加熱し、溶液を摂氏25度に30分間冷却します。各プローブについて、増幅バッファー中で一致するヘアピンペアを1対50の比率で希釈し、ゲルあたり300マイクロリットルを調製します。
混合物をボルテックスした後、混合物をゲルに加えてインキュベートします。ライトシートイメージング用のゲルを装着するには、ゲルホルダーのゲル付着面に1マイクロリットルのポリリジンを2回塗布し、コートの合間に37°Cで乾燥させます。次に、カットが左側にくるように、ジェルをカバースリップに置きます。
絵筆を使用して、ゲルを処理された表面に1回の動きで移します。神経伝達物質関連遺伝子と神経ペプチド遺伝子は、成体のショウジョウバエの脳で異なる発現パターンを示しました。VGluTとGad1は、同じハイブリダイゼーションラウンドで共検出され、重複しない発現パターンが示されました。
AstAは視葉で強く発現し、中央複合体で弱い発現を示しました。Crzは外側部で高発現し、視葉ニューロンでは低発現レベルが観察されました。Tkは、ライトシート顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかにより、特定の分割GAL4ラインを使用してMer-GFP発現で同定されたH delta Dニューロンで検出されました。
FMRFamideは、Mer-GFPでマークされたPFGニューロンには存在しませんでしたが、周囲のニューロンでは検出されました。FB4Kニューロンの高解像度イメージングにより、VGluTおよびChAT/VAChT転写産物の空間分布が確認されました。AstAやCrzなどの神経ペプチドは、一部の細胞で非常に高発現しているため、単一の転写産物を表す個々の蛍光スポットを分離できなくなっています。
