私たちはテクニカル サポートを提供する刺激的な議論と占研究室のメンバーを提供するため張研究室のメンバーに感謝します。この研究は、NSFC は、中国の M.O.S.T. から 973 プログラムの (E.E.Z. および C.Z.) に 2012CB837700 の補助金 (C.Z.) に 31500860 によって、北京市政府から資金援助によってサポートされていました。E.E.Z. は、中国「の募集プログラムのグローバル青年専門家」によって支えられました。

このプロトコルのすべてのプロシージャは、中国の政府規制に従い機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、国立研究所の生物学、北京の承認を得て行った。
1. Cry1蛍光レポーターの建設
メモ: 発光システム2,12を使用して以前の概日リズム研究,13ヒューズ リズミカルなdLuc式を誘導するために不安定化ルシフェラーゼ(dLuc) と概プロモーター。蛍光レポーターを開発し、不安定化ルシフェラーゼは、リズミカルなdVenus式を誘導するために不安定化蛍光タンパク質 (dVenus) に置き換えられました。P (Cry1) の生成-d の金星記者には以下、構築する Addgene に現在提出されている学術の使用のためにすぐに利用できるでしょう。
<ol><li>機能マウスCry1プロモーター (+328-1208 bp 地域Cry1遺伝子転写開始サイト '-1 ' として指定されたに) を増幅します。PCR 酵素 (KOD プラス Neo) を使用して、F1 と R1 のプライマー (表 2を参照)、マウスのゲノムのテンプレートおよび製造元の PCR プロトコルCry1プロモーター DNA のフラグメントを増幅します。</li>
	<li>336 Cry114の概日時計機能にとって重要であるCry1遺伝子のイントロンを増幅します。F2 と R2 では、テンプレートとイントロン 336 DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのマウスのゲノムのプライマー PCR 酵素を使用します。</li>
	<li>金星を増幅します。F3 と R3、pVENUS N1 プラスミド テンプレートと金星の DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのプライマー PCR 酵素を使用します。</li>
	<li>NLS D2 DNA のフラグメントを増幅します。F4 と R4、pcDNA3.3 d2eGFP プラスミド テンプレートと NLS D2 DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのプライマー PCR 酵素を使用します。</li>
	<li>エクソン 1 として 1 の DNA のフラグメントを合成します。</li>
	<li>イントロン 336 と金星DNA フラグメント リンカーとして DNA のフラグメント 2 を合成します。</li>
	<li>PAAV-EF1a-ダブル floxed-hChR2 (H134R) をカット - mCherry - WPRE-HGHpA ベクトル プラスミド酵素 EcoRI と MluI を。大きい DNA のフラグメントを浄化するためにゲルの抽出キットを使用します。製造元のプロトコルを使用します。</li>
	<li>ギブソン アセンブリ ミックスとその標準的なプロトコルを使用して、一緒に pAAV P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA レポーターを生成する DNA 断片のすべてを組み立てます。製造元のプロトコルを使用します。</li>
</ol>2. アデノ随伴ウイルス15の生産
<ol><li>準備の次のプラスミド DNA 株式: pRV1 の 31.25 μ g、pH21 の 31.25 μ g、pFdelta6、125 μ g、62.5 μ g (Cry1) - intron336 - pAAV-P の金星-NLS-D2 WPRE HGHpA。</li>
	<li>293 t 細胞の 5 の 15 cm の料理を準備し、セル 90% 合流になるまで待ちます。</li>
	<li>トランスフェクション試薬のプロトコルに従う 297T 細胞へ、プラスミドを transfect します。各料理の使用 pRV1 の 6.25 μ g、pH21、pFdelta6 の 25 μ g、pAAV P (Cry1) の 12.5 μ g 6.25 μ g-トランスフェクション試薬の intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA、および 120 μ L。</li>
	<li>トランスフェクション後、72 h デタッチ ピペット銃; を使用して各板からセル2 つの 50 mL チューブに細胞を収穫します。</li>
	<li>10 分間 800 x g で細胞のペレット、上澄みを廃棄します。各管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 mL を配置することによって、細胞を洗浄します。10 分間 800 x g で細胞のペレット、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>150 mM の NaCl と 20 ミリメートル pH 8.0; トリス ソリューションでペレットを再懸濁しますソリューション/チューブ 25 mL を使用してください。各チューブに作りたて 10% デオキシ コール酸ナトリウム (dH2O) での 1.25 mL を追加します。50 mL 単位の最終的な集中に benzonase ヌクレアーゼを加え、徹底的に混ぜます。37 ° C 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>15 分間 3000 × g で遠心分離して細胞の残骸を削除します。さらに 0.45 μ m シリンジ フィルターを通して混合物を押すことによりすべての残骸を削除されていることを確認します。この手順は、ヘパリン列のブロッキング防止に役立ちます。</li>
	<li>ペリスタ ポンプ; ヘパリン段組みを設定します。1 mL/分列に気泡が発生しないことを確認するには、フロー レートを設定します。</li>
	<li>150 mm NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 ml の 10 列を平衡します。各列にウイルスが含まれているソリューションを追加します。20 ml の 100 mM NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 の列を洗います。5 mL のシリンジを使用して、300 mM の NaCl の 1 mL と 20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 その後 200 mM の NaCl の 1 mL と 20 mM トリス溶液 pH 8.0、列を洗います。</li>
	<li>溶出が 400 mM の NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0、3 mL で 450 mm NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0、4 mL に続いてウイルス 5 mL 注射器を使用、最終的に 500 mM の NaCl の 3 ml、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0。抽出された材料を収集します。</li>
	<li>組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 濃度、100,000 分子量カットオフを持つ遠心フィルター ユニットに抽出された材料、一度に 4 mL を読み込みます。流れを破棄、室温で 5 分間 2000 x g で各 4 mL のサンプルを遠心します。</li>
	<li>すべて抽出された材料は、遠心ろ過ユニットを介して実行されている、PBS の 4 つの mL を追加し、約 250 μ L に混合物を遠心分離機します。RAAVs を削除 (ウイルス力価についてする必要があります 2-8 × 10 mL あたり12ウイルス粒子) 遠心ろ過ユニット、因数および使用まで-80 ° C でストアから。この段階でウイルスを数ヶ月間保存できます。</li>
</ol>3. 下さい rAAV 注入と光ファイバー挿入アダルト マウス SCN
<ol><li>SCN に概蛍光レポーターを運ぶ rAAVs の注入<ol>
<li>下さい rAAV の 5 μ L を読み込む (ウイルス力価は約 1 mL あたり 10 の12ウイルス粒子 x 2 8) マイクロ シリンジに。</li>
		<li>ネンブタール (80 mg/kg) とアダルト マウス (2 に 5-ヶ月歳、C57BL/6 背景) を腹腔内注射で麻酔します。つま先ピンチ応答の欠如によって十分な麻酔深度を確認します。</li>
		<li>はさみを使用して、マウスの頭から毛皮を外し、脳定位固定装置にマウスをマウントします。循環温水毛布または別の暖房装置を介して麻酔下の動物に熱源を提供します。 注: また、毛皮を削除するのに脱毛クリームや電動バリカンを使用します。</li>
		<li>適切な消毒剤で手術部位をきれいに。たとえばは、滅菌水またはアルコールとヨウ素、betadine、またはスクラブを交互にクロルヘキシジン希釈これできませんでした。少なくとも 3 回を繰り返します。手術部位をドレープします。</li>
		<li>はさみを使用して頭皮の切開をするし、頭蓋骨を公開します。</li>
		<li>脳定位固定装置を調整前とラムダは、同じ水平面;同じ水平面の前の 2 つの対称的なポイントを作る。</li>
		<li>4% に浸した滅菌綿棒の使用 H2O2/H2O 脳骨膜を腐食します。頭蓋骨の表面を乾燥をオフにきれいな、滅菌綿棒を使用しています。</li>
		<li>マイクロ ドリルを使用して、横になる穴約 1 mm 0.46 mm 後部と 0.25 mm の直径の前に。</li>
		<li>
fi生理食塩液クリーンな滅菌綿棒を使用すると、脳の表面からの骨の破片をクリアします。</li>
		<li>マイクロ注射器の先端が 0.46 mm 後方に, 脳と頭蓋骨の表面から前と 5.7 mm 0.25 mm 外側マイクロ シリンジに挿入します。</li>
		<li>500 を注入下さい rAAV の拡散を確実に注入後 10 分位でマイクロ シリンジを残して、SCN に下さい rAAV (50 nL min-1) の nL。</li>
		<li>マイクロ シリンジをゆっくりと引き出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SCN エリアに光ファイバーを挿入します。<ol>
<li>光ファイバーのナイフを使用して、光ファイバーの両側がスムーズであることを確認して作り、長さは繊維の 17 mm をカットします。</li>
		<li>セラミック フェルールに光ファイバーを挿入し、光ファイバーとセラミック フェルールの表面を確実にフラッシュ メチルエチルケトン過酸化 (AB 接着剤)、セラミック フェルールに光ファイバーを修正します。</li>
		<li>冷滅菌ソリューションまたはエチレン酸化物繊維をきれい。</li>
		<li>下さい rAAV 投与 (ステップ 3.1.11) SCN にセラミック フェルールを含む光ファイバーを挿入します。</li>
		<li>セラミック フェルールと歯科用レジンを使用して頭蓋骨に光ファイバーを修正し、乾燥することができます。</li>
		<li>バックのマニキュアで歯科用レジンの表面を汚れ。3.2.5 3.1.2 へ下さい rAAV 制御のための実際の注入を省略することで説明されている手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手術後のケア<ol>
<li>術後鎮痛剤、ブプレノルフィン 2 mg/kg 体重、皮下、マウスを提供する 1 日 2 回。</li>
		<li>麻酔から出てくる中、回復ケージにマウスを配置します。</li>
		<li>ハウス食品/水使用可能な自由で 12 h 光/暗い条件 (ケージの下部に 〜 100 ルクス光強度) の下で個別にマウス。8 日は、さらに実験を可能にする十分な回復時間と最適な蛍光レポーターの発現を確認する前に割り当てられるべき。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.生体内蛍光信号モニタリングとデータ収集
<ol><li>術後後 8 日目は蛍光信号のモニターとマウスの頭に光ファイバーを接続 (e.g。、遺伝子オブザーバー)。バック グラウンド信号を確立するマウスの SCN の蛍光信号を確認してください。観察・蛍光信号モニターを使用してこの信号の計測を行います。</li>
	<li>コントロール マウスの同じ操作の実験マウスの蛍光信号を評価します。これは可能性が高い光ファイバーの先端が SCN を欠場していることを示します、マウスではウイルスのベクトルを受け取っているが、これはのみの分析からバック グラウンド信号を表示を除外します。これらの最初の措置後、マウスを安定させるために蛍光信号を許可する別の 3 週間のホーム檻に戻ります。</li>
	<li>3 週間後に、蛍光信号のモニターとマウスを接続します。15 の蛍光を測定 s 周波数 100 Hz で、10 分毎。これらの測定中に、マウスは食品/水使用可能な自由と檻の中で自由に動いています。〜 100 ルクスのケージの下部に光強度を使用して、15-20 μ の光ファイバーの先端にレーザー パワー。</li>
	<li>すべての録音完了後 4% パラホルムアルデヒドでマウスを灌流し削除し、光ファイバーの配置をチェックする脳をスライスします。光ファイバー先端が SCN は、正しく注入されていないいる場合、マウスを解析から除外します。</li>
</ol>5. データ分析とプレゼンテーション
<ol><li>メジャー蛍光信号 15 10 分毎 1500 のデータ ポイントを生成するための 100 Hz の周波数で s。これらの 1500 ポイントの平均は、任意の特定の時点で蛍光信号に変換します。自由行動マウスの SCN は、制御光条件下でCry1の転写リズムに対応する信号-時間曲線を生成時間をかけて複数の平均をプロットします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system.">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li><li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+preparation,+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus.">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice.">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310 (2015).</li><li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+PER2::LUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms.">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li><li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs.">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms.">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).</li><li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag.">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li><li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abrupt+shift+in+the+day/night+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center.">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li><li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

前のヴィヴォメソッドでは、スライス文化4、5RT-PCR 法16の in situハイブリダイゼーション17動物が殺されることを必要とするなどとは対照的体内法を記録できます。生きている動物の概日遺伝子発現を研究する研究者。そのため、この技術は、ニューラル サーカディアン ・ クロックについて?...

哺乳類の視交叉上核 (SCN) は外因性の環境の変化(例えば光、温度、圧力等)1の個々 の応答を調整するための全身の概日リズムを支配します。時計のコア コンポーネントは、 Per1 3 Cry1 2、クロック、およびBmal1から成り、各セルの体内時計の調節に中心的な役割を果たします。SCN の各セルに転写活性化因子、時計/BMAL1 は、あたりの発現を誘導するヘテロダイマーとして機能が含まれていますと泣く。1 件/泣くコンプレックスは、時計/BMAL1 約 24 時間は、完全な2,3転写翻訳フィード バック ループを形成するための機能を阻害します。
SCN に関する先行研究は主に前のヴィヴォSCN スライス培養法4,5,6を採用しているし、このアプローチは、貴重な情報を提供して、一方その限界抑制する当社の能力この重要な地域に存在する細胞に及ぼす外因性刺激 (例えば、光) と同様に、SCN に他の脳の核の影響に関するデータを取得します。2001 年岡村仁グループ自由行動マウス7SCN のモニター時計遺伝子体内に発光システムを使用する第 1 だった。本間健一のグループは、生物発光、生体内でSCN8,9,10の記録システム開発さらに過去数年間を費やしてきた。一緒に、これらの研究は、暗黒や光パルスの後、概日時計を監視する能力を持つ研究者を提供しています。ただし、発光は光が体内時計11SCN を介した同調に必要な支配的な信号であるという事実と相まってダーク/ライト サイクル中に継続的な監視を可能にするのには暗すぎるためには生物発光の記録に関連付けられている制限を克服する実験法の開発のための需要が増加しています。現在のレポートでは、SCN は、生体内で自由行動マウスの体内時計を監視するため建設された蛍光ベースのシステムについて説明します。この簡単に使用できるメソッドは明暗サイクル中に継続的な監視が可能でき、高時間分解能のリアルタイムでの SCN における概日時計遺伝子の転写の長期観察のため。

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin columns</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 centrifugal filter</td><td>EMD Millipore</td><td>&amp;nbsp;UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Make fresh solution for each batch</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &amp;Oslash;200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>microsyringe pump</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ceramic ferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&amp;thinsp;&amp;mu;m I.D., 2.5 mm O.D.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

この手法では、遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子レポーターの正確な配信を介した光ファイバー蛍光録音を組み合わせたものです。自由行動マウスの視交叉上核 (SCN) のCry1、時計遺伝子の転写リズムを記録するこの新しい使いやすい体内蛍光監視システムが開発されました。これを行うには、 Cry1転写蛍光レポーターはように設計されアデノ随伴ウイルスにパッケージ化します。精製、濃縮されたウイルスは、マウスの脳の表面に固定し、光ファイバーの挿入に続いて SCN に注入されました。動物は彼らの家のケージに返され、記者表現を確保するため 1 月手術後の回復期間を許可しました。蛍光生体内で私たちの機関で構築されたシステムの監視を介してマウスを自由に移動で、記録されました。生体内で記録システム、488 nm のレーザー光を分割と同等の力の 4 つのレーザー励起出力 1 × 4 のビーム ・ スプリッターと結合されていました。このセットアップでは、同時に 4 匹の動物から記録することができました。放出される蛍光信号の各は、光電子増倍管とデータ集録カード経由で集められました。対照的に概日時計記録技術体内前生物発光にこの蛍光体内の記録システムにライト サイクルにおける概日時計遺伝子の発現の録音を許可します。

Cry1の蛍光レポーターの設計は、図 1 aのショーだった。上記、500 の詳細なアプローチを使用して下さい rAAV P - intron336-(Cry1) の nL 金星-NLS-D2 アダルト マウスの SCN に正常に注入された、堅牢な金星式 (図 1 b、1 C) を展示します。12/12 h ライト/ダーク (LD) と暗い/暗い (DD) 条件 (図 2</stron...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters at JoVE.com

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN) における概日時計遺伝子の転写の長期監視できます。

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

8.2K ビュー.  Peking University. この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN) における概日時計遺伝子の転写の長期監視できます。

ビデオ: In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

遺伝学

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

神経科学

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

発生生物学

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

生物学

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

概日リズム研究のためのヒト腸腸エンテロイドの最適化

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

著者スポットライト:多細胞系における概日リズムのin vitro研究

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...