私たちの研究は、光によるタンパク質活性の精密な時空間制御を実現する光遺伝学的手法の開発に着目しています。私たちは、アロステリック制御のためにlightRと呼ばれる光調節可能なドメインを設計し、時空間的に制御されたタンパク質活性が細胞シグナル伝達と機能にどのように影響するかを研究し、前臨床疾患のモデリングと治療法の開発に役立てることができます。オプトジェネティクスは、標的タンパク質活性の精密かつ可逆的な制御の実現や、内因性シグナル伝達速度の正確な模倣など、いくつかの課題に直面しています。
重要な問題は、望ましくない活性化の防止、標的を絞った細胞内活性化の実現、細胞生存率を維持するための光毒性の管理です。さらに、汎用的で堅牢なツールを開発することは、アプリケーションの汎用性と再現性を向上させるために重要です。当社の lightR ツールエンジニアリング用プロトコルは、アロステリック制御、高感度、空間分解能、厳密な時間制御、正確なシグナル伝達特異性など、複数の高度な機能を 1 つのシステムに独自に組み合わせています。
この統合により、多様な標的タンパク質間でのチューニングが可能になり、これらの重要な機能の1つ以上が欠けている可能性のある他の方法のギャップを解決できます。私たちは、細胞遊走を調節する主要なシグナル伝達と構造プロセスを定義することに関心があります。私たちは、光遺伝学的技術を用いて、内皮細胞の遊走と相互作用の制御を解剖することを目指しています。
細胞外マトリックスのリモデリングが内皮細胞によってどのように媒介されるかを理解し、これらのプロセスの調節不全が疾患の発症にどのように寄与するかを判断します。各実験群の3.5cm細胞培養皿に対して、10×10の負荷で3.5cmの細胞培養皿をlightRキナーゼプレートの生化学的解析のために、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で16〜18時間インキュベートします。翌日、適切なトランスフェクション試薬を使用して、選択したDNAコンストラクトで細胞をトランスフェクションします。
皿をアルミホイルで覆い、インキュベーターに戻します。トランスフェクションの16〜18時間後、組織培養インキュベーター内に465ナノメートルのLEDパネルランプシステムを配置します。穴あきプレキシガラスパネルをランプの10センチメートル上に配置して、1平方センチメートルあたり3ミリワットの照明を実現します。
LightR-SrcおよびD388 R-LightR-Srcを発現する細胞には連続照明を使用してください。LEDパネルを手動でオン/オフして、照明を制御します。実験時間の終了時に、安全な赤色光の下で細胞を採取し、培地を吸引し、細胞を冷たいPBSで洗浄します。
遺伝子操作されたLightR-Srcを用いたlin XE細胞の全光照射60分間は、Src基質、内因性パキシリン、および触媒的不活性D388 RLightR-Src変異体を発現するp130Cas細胞のリン酸化を示し、全球照明ではSrc基質のリン酸化を示さなかった。まず、細胞培養培地中の35mm組織培養皿に10倍5個のヘラ細胞を2回プレートします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で2時間インキュベートします。
細胞が付着し、60〜70%の密度に達したら、与えられた混合物でhella細胞をコトランスフェクションします。セルが誤って点灯するのを防ぐために、皿をアルミホイルで覆います。次に、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で16〜18時間インキュベートします。
次に、直径25ミリメートル、厚さ0.17ミリメートルの蓋ガラスを6ウェルプレートチャンバーに入れます。3つの丸いガラスカバースリップに1リットルあたり5ミリグラムのフィブロネクチンをPBSでコーティングし、摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、トランスフェクションの16〜18時間後にカバースリップをPBSですすいでください。
トランスフェクションされたヘラ細胞を安全な赤色光で収集し、その後、安全な赤色光の下で各カバースリップに5つのトランスフェクションされたヘラ細胞の累乗で約1回10回再生します。プレートをアルミホイルで覆い、細胞培養培地で摂氏37度、二酸化炭素5%で2時間インキュベートします。次に、調製したイメージングメディアと鉱物油を37°Cに温めます。
次に、細胞を含むカバースリップをPBSで2回洗浄します。細胞を染色して洗浄した後、カバースリップをライブセルイメージングチャンバーに慎重に入れます。1ミリリットルのL15イメージングメディアをチャンバーに加えます。
イメージング中の蒸発を防ぐために、あらかじめ温めた鉱物油を1ミリリットル培地に加えます。イメージングの準備ができるまで、チャンバーを摂氏37度の光から保護してください。チャンバーを摂氏37度に予熱した顕微鏡ステージに置きます。
高速なLightR-SrcチェリーとIRFPのSrcの両方を発現する単一細胞を選択します。照らすセル内の特定の関心領域を選択します。この研究では、選択した細胞の周辺にある小さな領域を選択します。
選択した細胞を、照明前の基礎状態で20分間、毎分イメージングします。局所的に照らしながら50分間イメージングを継続し、その後、活性化後20分間、合計90分間イメージングを続けます。イメージング後、ムービーをTIFスタックファイル形式で保存して分析します。
hela細胞の全球照明は、高速LightR-Srcの焦点接着への局在化につながり、青色光がオフになると逆転しました。この照明はまた、細胞の拡散の大幅な増加を引き起こし、青色光がオフになると停止しました。触媒的に不活性なD388 R-LightR-Src変異体は、細胞の広がりを示さなかった。
高速LightR-Srcを発現するhela細胞を局所的に照射すると、焦点接着にコンストラクトが蓄積し、50分間の照射で局所的な膜突起が生じました。照明後20分間の暗所では、それ以上の面積増加は観察されませんでした。Fast LightR-Srcは、暗期の焦点接着から徐々に消えていきました。
細胞重心は、照らされた領域に向かってシフトしました。LightR-Srcの高速活性化に続いて、細胞の指向性運動を示します。
