私たちは、好中球の細胞外トラップまたはNETを定量するためのリアルタイム顕微鏡法を開発しました。これらのNETは、自然免疫防御に重要な役割を果たしています。しかし、組織内にNETsが蓄積すると、複数の炎症性疾患や自己免疫疾患の病態生理に寄与することが明らかになっています。
NETsの病理学的な意味合いから、NETosis拮抗薬の開発に対する関心が高まっています。NETosis阻害を研究するために、ヒトNETリリースを定量化するためのリアルタイム顕微鏡法を開発し、NETosisとその阻害をハイスループットで研究することを可能にしました。好中球は敏感な細胞であり、機械的、微生物的、その他の種類のストレスにより、精製プロセス中に刺激に対する反応性を変化させる可能性があります。
したがって、好中球の活性化を最小限に抑えるために、好中球単離プロトコルを検証することが重要です。したがって、この手法により、健康な個人と病気の個人からのNET放出の研究が可能になります。さらに、さまざまな生理学的刺激によって誘発されるNET形成の動力学を研究することができます。
このハイスループット顕微鏡技術により、シトルリン化ヒストン2Aおよび4を標的とするモノクローナル抗体であるNETosisアンタゴニストCIT-013が、IC 50または4.6ナノモルでNET放出を効率的に阻害できることを実証することができました。このことは、このアッセイがNETosisアンタゴニストの試験に適していることを示しています。健康なボランティアから末梢血をリチウムヘパリンチューブで採取した後、血液を新鮮な50ミリリットルチューブに移します。
リチウムヘパリンチューブをDPBSですすぎ、同じ50ミリリットルチューブに移して、血液とDPBSの比率が1:1であることを確認します。混合後、密度勾配溶液の上に希釈した血液を加えます。血液を400Gで40分間遠心分離し、最小限の加速と休憩で行います。
10ミリリットルのピペットで上部のプラズマ層を廃棄します。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、末梢血単核細胞と密度勾配溶液を廃棄します。赤血球と好中球を含む層を静かに振とうしてから、15ミリリットルのDPBSに再懸濁します。
25ミリリットルの6%デキストランと0.9%塩化ナトリウム溶液を加え、チューブを反転させて混合します。25分間のインキュベーション後、10ミリリットルのピペットで上部の好中球層を新鮮な50ミリリットルのチューブに移し、500Gで10分間遠心分離します。チューブをデカントして上清を捨て、ペレットを10ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解緩衝液に再懸濁します。
同じ溶解バッファーを40ミリリットル加え、溶液が半透明になるまでチューブを連続的に反転させながら室温でインキュベートします。チューブを350Gで10分間遠心分離します。上清を取り除いた後、ゆっくりと滴下して、好中球を懸濁液にせずに、好中球ペレットの上に5ミリリットルの培地、10%を加えます。
好中球ペレットの上部に存在する赤血球のほとんどが培地に再懸濁されるまで、チューブを静かに渦巻かせます。上清を除去した後、好中球ペレットを10ミリリットルの培養培地に再懸濁し、10%完全に再懸濁したら、最大50ミリリットルの培養培地を10%追加し、混合物を遠心分離してから、ペレットを10ミリリットルの好中球細胞外トラップまたはNETアッセイバッファーに再懸濁します。まず、96ウェルプレートの各ウェルに0.001%ポリ-L-リジン溶液を加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。
200マイクロリットルのDPBSでウェルを3回洗浄し、ウェルを風乾します。次に、必要な数の好中球をNeutrophil Extracellular TrapまたはNETアッセイバッファーに再懸濁します。NETアッセイバッファー中の4倍濃縮DNA色素を各ウェルに移します。
NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosis刺激を対応するウェルに加えます。次に、NETアッセイバッファーおよび好中球懸濁液中の4倍に濃縮されたNETosisアンタゴニストを対応するウェルに加えます。プレートを100 Gで2分間遠心分離します。
次に、プレートをインキュベーターに設置した生細胞顕微鏡分析システムに、摂氏37度、二酸化炭素5%で挿入します。好中球懸濁液を含む96ウェルイメージングプレートを生細胞顕微鏡分析システムに置いた後、システムソフトウェアを開きます。[スケジュール] をクリックして取得し、プラス ボタンをクリックして起動します。
次に、[スケジュールに従ってスキャン]を選択し、[次へ]をクリックします。新しい船を最初から作成するには、船舶の作成セクションで新規を選択し、次へをクリックします。「スキャン・タイプ」セクションで、「標準」を選択し、「次へ」をクリックします。
スキャン設定をセルごとに選択し、なしを選択します。画像チャネル、緑の位相コントラスト。取得時間、100ミリ秒、対物レンズ20倍。
次に、「次へ」をクリックします。「Vessel Selection」セクションから、スキャンする適切なタイプの船舶を選択し、「Next」をクリックします。容器のドロワー内の位置を指定し、[次へ] をクリックします。
[スキャンパターン]セクションで、スキャンする必要のあるウェルとウェルごとの画像の数を選択します。「次へ」をクリックします。「Vessel Notebook」セクションで、船舶に関する情報を入力します。
プレート名を入力し、[次へ]をクリックします。「解析設定」セクションで、「解析を延期」を選択し、「次へ」をクリックします。「スキャン・スケジュール」セクションで、「次の間隔でスキャンする新しいスケジュールを作成する」を選択し、「スキャンをスケジュールに追加」セクションで「1 時間」を選択します。
[最初のスキャンから 5 時間後にスキャンを停止する] を選択します。[次へ] をクリックし、[追加] をクリックして、スキャン情報が正しいときにスケジュールを設定します。好中球の位相差画像と免疫蛍光画像を取得した後、生細胞顕微鏡解析ソフトウェアを起動します。
ビューから、解析する生細胞顕微鏡実験を選択します。「新規分析定義の作成」を選択し、「次へ」をクリックします。次に、[Analysis Type] セクションから [Basic Analyzer] を選択し、[Next] をクリックします。
「イメージチャネル」セクションで、緑色を選択し、フェーズの選択を解除して、「次へ」をクリックします。画像レイヤーウィンドウを開き、緑色を選択してフェーズの選択を解除します。緑色のセクションで自動スケールをオフにし、最小と最大を手動で設定します。
次に、容器のスキャン時間ウィンドウを開き、NETを使用したポジティブコントロールウェルを表す画像を選択します。解析定義設定ウィンドウを開き、オブジェクト名にNETsを書き込みます。セグメンテーションには、[アダプティブ] を選択します。
しきい値 GCU の場合は、3 から 5 まで選択し、[Edge Split On] をマイナス 10 から 0 の間で設定します。次に、クリーンアップのために、[穴埋め]を100平方マイクロメートルに選択し、サイズをマイナス1ピクセルに調整します。[フィルター] から、200 平方マイクロメートルを超える領域、24.6 未満の [平均強度] 、7, 000 を超える [統合強度] を選択します。
次に、[現在のプレビュー] または [すべてプレビュー] をクリックして設定を適用します。さまざまな NET 構造にカーソルを合わせ、解析設定を調整して、偽陽性と偽陰性の NET を微調整します。NET 分析の設定が正しい場合は、[次へ] をクリックします。
「スキャン時間とウェル」セクションで分析するタイムポイントとウェルを選択し、「次へ」をクリックします。「Analysis Definition の保存と適用」セクションに定義名を挿入し、「Next」をクリックします。解析情報が正しいことを確認したら、[完了] をクリックします。
目的の容器内の解析をクリックして、実験解析を開きます。次に、グラフ メトリック ウィンドウを開きます。次に、プラスボタンをクリックしてメトリックを作成します。
データを NET Confluency の割合で表示する場合は、[メトリック] セクションで [面積] を選択し、[値] セクションで [Confluence] を選択します。NETting好中球の割合としてデータを表示する場合は、[メトリック]セクションで[オブジェクト数]を選択し、[値]セクションで[画像ごと]を選択します。メトリック設定を構成した後、ユーザー定義のメトリック セクションで、[NETs Area Confluence] または [NETs Object Count Per Image] を選択します。
分析に必要なすべての時点とウェルを、Select ScansセクションとSelect Wellセクションからそれぞれ選択します。最後に、[データのエクスポート] をクリックします。カルシウムイオノフォア刺激は、PMAと比較してより速いNETosisを誘発し、その結果、NETを放出する好中球の割合が高かった。
カルシウムイオノフォアによって誘導されたNETは、好中球の原形質膜を超えてより拡散したが、PMAによって誘発されたNETは好中球の原形質膜に近いままであった。好中球がコーティングされた免疫複合体、FMLP、および尿酸ナトリウム結晶で活性化されたときに、NETレベルの上昇傾向が観察されました。23187に応答したNET放出は、4.6ナノモルの半値阻害濃度でCIT-013によって完全に阻害されました。
