この手順の主な目標は、さまざまなインプラント表面でのマイクロファージの培養と特性評価、およびマイクロファージのサブタイプの特性評価のための包括的なプロトコルを実装することです。この特性評価の一環として、qRT-PCR、EISA、CLSM など、遺伝子発現プロファイル、分泌タンパク質、細胞表面マーカーを決定するためのいくつかの方法が採用されています。この結果は、マイクロファージとインプラント表面の分極、および遺伝子発現、分泌タンパク質、および細胞表面マーカーに基づいてそれらを正確に同定する上で、実施されたプロトコルの有用性と有効性を示しています。
さらに、マーカーは、MDMのさまざまなサブタイプを区別するために使用できる反乱の一貫した特異的な発現パターンを記述します。全体として、この研究は、成功した組織再生プロセスを改善および促進し、インプラント関連の慢性炎症を予防し、成功したインプラント統合を強化するための免疫調節材料の開発と設計に貢献します。まず、単離したヒト末梢血単核細胞を15ミリリットルの予熱した単球付着培地に再懸濁し、T-75細胞培養フラスコに移します。
細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で90分間インキュベートし、接着します。インキュベーション後、上清を捨て、フラスコを静かに傾けてフラスコを静かに傾けて、非接着性または緩く付着した細胞を除去することにより、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した予熱済みのRPMI 1640培地で細胞を一度洗浄します。1ミリリットルあたり10ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子を含む15ミリリットルの完全な培地を接着細胞に加えます。
そして、差別化を促進するために6日間インキュベートします。分化後、フラスコから培地を取り出し、細胞を10ミリリットルのPBSで5分間洗浄します。接着細胞を剥離するには、予め温めた細胞剥離液10ミリリットルを加え、30分間インキュベートします。
次に、フラスコを軽くたたいて細胞を放出し、50ミリリットルのチューブに移します。残りのセルを切り離すには、フラスコに10ミリリットルのPBSを追加し、セルをスクラップします。分離した細胞を50ミリリットルのチューブに移します。
分離した細胞懸濁液を300gで10分間遠心分離し、上清を廃棄してから、細胞を5ミリリットルの予熱済み完全培地に再懸濁します。トリパンブルー染色を使用して、血球計算盤で細胞をカウントし、細胞数と生存率を決定します。細胞数を160, 000細胞/1ミリリットルの完全培地に調整して、細胞懸濁液を調製します。
次に、生体材料ディスクを70%エタノールで超音波で5分間洗浄し、続いて70%エタノールで30分間滅菌します。チタンディスクを乾燥させた後、未処理の24ウェルプレートに入れ、調製した細胞懸濁液を1ミリリットルずつ各ウェルに加えます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートし、M0マクロファージを得る。
M1分極マクロファージを得るには、インターフェロンガンマとリポ多糖を24ウェルプレートのウェルに添加します。M2分極には、インターロイキン-4とインターロイキン-13を添加します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートし、分極を誘導します。
ヒト末梢血単核細胞から分極した単球由来マクロファージを得た後、細胞上清を1.5ミリリットルのチューブに集めます。チタンディスクを新しい24ウェルプレートに移します。細胞上清を300gで5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
サイトカインとケモカインを450ナノメートルで測定し、メーカーの指示に従ってください。分泌されたサイトカインまたはケモカインの濃度を標準曲線を使用して計算します。ビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを使用して総タンパク質量を測定します。
分泌されたタンパク質の濃度を全タンパク質のミリグラムに正規化します。分極したマクロファージを800マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。ディスクを400マイクロリットルの固定緩衝液に室温で20分間インキュベートします。
固定バッファーを取り外した後、ディスクを400マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。次に、ディスクを400マイクロリットルのブロッキングバッファーで30分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします。ブロッキングバッファーを廃棄し、400マイクロリットルの染色バッファーで希釈した一次抗体とディスクを1時間インキュベートします。
1時間後、一次抗体を取り出し、400マイクロリットルの洗浄バッファーでディスクを3回洗浄します。染色バッファーで希釈した標識二次抗体に蛍光を添加し、暗所で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを洗浄バッファーで3回、それぞれ3分間洗浄します。
PBSに10ミリモルのDRAQ5を加え、暗所で15分間インキュベートします。次に、上清を取り除き、椎間板をPBSで一度洗います。封入剤を1滴加え、5分後にカバーガラスを塗布し、サンプルを1時間乾燥させます。
乾燥後、透明なマニキュアで端を密封します。細胞の概要を把握するには、共焦点レーザー走査型顕微鏡でサンプルを25倍の倍率でイメージングします。倍率を63倍に変更して、サーフェスマーカーの構造と局在を決定します。
初代単球由来マクロファージは、チタン表面上でM1マクロファージとM2マクロファージにうまく分極され、CCR7はM1マクロファージで、CD209はM2マクロファージでより強く発現しました。qRT-PCR解析では、M1ではCCR7とTNF-α、M2ではCD209とCCL13の高発現により、チタンおよびカバースリップ表面の両方で初代単球由来マクロファージの分極が成功したことが示されました。高レベルの炎症性TNF-αサイトカインおよびCCL13ケモカインにより、タンパク質レベルでのM1およびM2分極が確認されました。
