ミクログリアによる網膜オルガノイドの組み立て

まず、幹細胞培地でヒト胚性幹細胞を細胞密度80〜90%で取得します使用済み培地を取り出した後、各ウェルの細胞を1ミリリットルの1X DPBSですすいでください。各ウェルの幹細胞コロニーを1ミリリットルの0.5ミリモルEDTAで摂氏37度で約5分間インキュベートします。コロニーの形態をチェックして、エッジがわずかに丸まって隙間が緩いことを確認します。

EDTAを吸引し、必要に応じて、細胞を摂氏37度でさらに1〜2分間、ただし8分以内にインキュベートします。各ウェルの細胞を、6マイクロリットルの10ミリモルROCK阻害剤Y-27632溶液を含む6ミリリットルの培地Aで穏やかにすすいでください。皿の底を軽くたたいて、細胞をすすぎます。

24時間後、顕微鏡で細胞を観察し、胚体の形成を確認します。10ミリリットルのピペットを使用して、胚体を15ミリリットルの遠心チューブに集め、胚体が底に落ち着くのを5分間待ちます。次に、上清を慎重に吸引し、胚体を6ミリリットルの新鮮な培地Aに再懸濁します。それらを6ウェルプレートの新しい低接着ウェルに移し、摂氏37度のインキュベーターで培養します。

4日目に、10センチメートルの皿に3ミリリットルの0.1%魚ゼラチン溶液をコーティングし、5%二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。次に、ゼラチン溶液を取り出し、5〜6ミリリットルの1X DPBSで皿を一度すすいでください。胚体を15ミリリットルの遠心チューブに慎重に集め、胚体が底に落ち着くのを待ちます5分で。

胚体を15ミリリットルの培地Bで穏やかに再懸濁し、コーティングされた10センチメートルの皿に移します。摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで49日後に1週間培養します。細胞を200 x gで室温で5分間遠心分離します。

上清を慎重に吸引し、2ミリリットルの新鮮な培地で細胞を再懸濁しますC.6ウェルプレートの新しい低接着ウェルに移します。プレートを5%二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーターでインキュベートします。56日目に、使用済みの培地をウェルごとに2ミリリットルの培地Cと交換します。

顕微鏡でプレートを検査し、低接着ウェルの底に付着している分岐したミクログリアを特定します。ミクログリアを採取して共培養するには、各ウェルの培地Cを1ミリリットルのアキュターゼに穏やかに交換し、摂氏37度で3分間インキュベートします。5ミリリットルのピペットを使用して、ミクログリア細胞を15ミリリットルのチューブに集め、細胞を200 x gで室温で5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、ミクログリアを1ミリリットルの培地Eで懸濁します。