当社の改変3Dアッセイ培養は、がん微小環境におけるさまざまな成分の役割を調べるために使用でき、新しいバイオマーカーや創薬標的の同定につながります。この方法により、免疫系によく似た細胞表現型と分子シグナル伝達の変化を研究することができます。また、試験の特定の要件を満たすように変更することもできます。
この方法は、乳がんの早期発見に役立つ新しいバイオマーカーを特定するのに役立ちます。また、分子の洞察は、新規創薬標的の同定に活用できます。この方法は、遺伝子または遺伝子が果たす役割についての洞察を提供できる遺伝子の摂動後の腫瘍形成および形態形成の両方を研究するために使用することができる。
はじめに、培地を吸引し、2ミリリットルのPBSで洗浄することにより、細胞をトリプシン処理します。900マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加え、摂氏37度で約15分間、または細胞が完全にトリプシン処理されるまでインキュベートします。各ウェルを60マイクロリットルのlrECMでコーティングすることにより、チャンバー付きカバーガラススライドの8つのウェルにlrECMのベッドを準備します。
摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに最大15分間入れます。細胞懸濁液を調製するには、5ミリリットルの再懸濁培地を加えてトリプシン活性を消光し、細胞を112倍gで摂氏25度で10分間回転させます。使用済みの培地を吸引し、細胞を2ミリリットルのアッセイ培地に再懸濁します。
懸濁液をよく混合して、単一細胞懸濁液を確実に形成する。血球計算盤を使用して細胞を数え、各ウェルに6, 000個の細胞を播種するのに必要な細胞懸濁液の量を計算します。必要なウェルの数に応じて、細胞懸濁液をオーバーレイ培地で希釈します。
調製したlrECM床に400マイクロリットルの希釈細胞懸濁液を加え、lrECM床を乱さないように注意します。加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。3時間後、各ウェルに200ナノモルのPAFを加えます。
培地交換のたびに同じ濃度のPAFを加え、4日ごとに細胞に新しい培地を補充します。20日間の培養後、各ウェルから培地を注意深くピペットで取り出し、400マイクロリットルの予熱PBSでウェルを洗浄します。新たに調製した4%パラホルムアルデヒド400マイクロリットルを加え、室温で20分間インキュベートすることにより、腺房構造を修正します。
氷冷したPBSでウェルを一度すすぎ、0.5%Triton X-100を含むPBSで摂氏4度で10分間透過処理します。10分後、Triton X-100溶液を注意深くピペットで取り出し、400マイクロリットルの新たに調製したPBSグリシンですすいでください。10%ヤギ血清を含む一次ブロッキング溶液400マイクロリットルを免疫蛍光バッファーに加え、室温で60分間インキュベートします。
一次ブロッキング溶液を除去し、一次ブロッキング溶液に調製した2%二次ブロッキング抗体を200マイクロリットル加え、室温で45〜60分間放置します。一次抗体を1:100希釈の2%二次ブロッキング抗体溶液で調製します。二次ブロッキング溶液を除去し、新たに調製した抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。
一次抗体溶液を慎重にピペットでピペットし、400マイクロリットルの免疫蛍光バッファーで3回洗浄します。次に、一次ブロッキング溶液中の蛍光色素標識二次抗体の1:200希釈液を調製し、二次抗体溶液中でスライドを室温で40〜60分間インキュベートします。スライドを400マイクロリットルの免疫蛍光バッファーで20分間すすぎ、続いてPBSでそれぞれ10分間2回洗浄します。
核染色液1ミリリットルあたり0.5ナノグラムを含むPBSで、室温で5〜6分間、核を対比染色します。スライドを400マイクロリットルのPBSで3回洗浄して、余分な汚れを取り除きます。PBS全体を慎重にピペットで取り出し、残留溶液を確実に除去します。
次に、各ウェルに1滴の封入試薬を加え、室温で一晩放置します。最後に、共焦点顕微鏡で40倍または63倍の倍率でスライドを画像化し、0.6ミリメートルステップサイズの光学Zセクションを撮影します。画像は、核染色で染色された腺房内の細胞の核を表しています。
ここでは、アシニの3D構築と、lrECM上で20日間成長させたMCF10Aアシニの位相差画像を示します。最も中央のセクションは、中空の内腔の存在を示しています。PAFは極性を破壊し、MCF10A乳房腺房にEMT様変化を誘発します。
MCF10A細胞は、lrECMで3Dオントップの培養物として増殖させた。培養物を0、4、8、12、および16日目にPAFで処理した。培養物を20日間維持した後、α6-インテグリンおよび核染色、頂端極性のマーカーであるGM130、およびEMTマーカーであるビメンチンについて免疫染色しました。
それぞれの腺房の一番中心のスタックがここに示されています。代表的なデータは、3つの生物学的に独立した実験からの40〜50 aciniに関するものである。lrECMベッドは、気泡なしで均等に広がるように慎重に作成する必要があります。
また、細胞懸濁液は均一に混合し、凝集を避けるためにゆっくりと添加する必要があります。3D培養からタンパク質とRNAを取得し、それを使用してさまざまな分子経路を調べることができます。
