この方法は、癌細胞が剥離および侵入する能力を視覚化および定量化し、それによって作用形成または転移の前にそれらの転移性攻撃性を評価することができる。スコアリングは、転移形成の前提条件としての層間剥離プロセスに基づいており、それによって細胞の転移攻撃性に関する情報を比較的速く、容易かつ安価な方法で達成すること。実際の実験を開始する前に、まずさまざまな個々のステップを練習してください。
CAM-Delamアッセイには、書面で説明するのが難しいいくつかの技術的ステップが含まれており、視覚的なデモンストレーションによって理解し、学ぶのがはるかに簡単です。卵トレイに所望の数の卵を入れ始め、ひよこの卵を卵インキュベーター内で水平に孵化させる。次に、70%エタノールを噴霧して、30個の計量ボートと透明なキャップ付きの30個の小さなプラスチックボックスを滅菌します。
次に、計量ボートと箱を層状フードで一晩乾燥させ、インキュベーション3日目にさらに使用するまで閉じたプラスチック箱に保管します。30個の孵化した卵、2対のはさみ、および3対の鉗子あたり2リットルの蒸留水または脱イオン水を滅菌する。まず、滅菌したプラスチック製の箱に約50ミリリットルの滅菌水を加え、蓋を閉めます。
孵化3日目に、はさみの鋭い部分を使って卵の殻を割り、殻のまっすぐな開口部を切ります。計量ボート上で卵殻を手動で開いた後、卵白、卵黄を集め、計量ボートに健康な胚を付着させます。次に、鼓動する心臓、無傷の卵黄、および実験のために発達した血管を有する無傷の胚を探す。
次に、計量ボートを内部加湿チャンバーに静かに移し、内部加湿チャンバーを卵インキュベーター内でインキュベートする。シリコーンリングを作製するには、内径4mm、外径5mmのシリコーンチューブを、好ましくはペーパーカッターを用いて、それぞれ約1mmの厚さに切断する。次に、シリコーンリングを小さなガラス瓶に移します。
金属箔で覆い、オートクレーブなどを使って滅菌してください。滅菌シリコーンリングを室温で保存する。目的の癌細胞株を細胞培養において関連する培養培地で培養する。
その後、1ミリリットルのコラーゲンRPMIミックスを準備し、氷の上に保管します。次に、癌細胞をトリプシン処理し、まず細胞培養培地を除去して洗浄することにより細胞を単離する。次いで、直径15センチメートルの細胞培養皿あたり3ミリリットルのトリプシン溶液を加え、細胞が剥離するまで細胞培養インキュベーター内で2〜3分間インキュベートする。
卓上倒立顕微鏡を用いて、剥離した細胞を見る。次いで、各細胞培養皿に5ミリリットルの完全RPMI培地を加えてトリプシンを不活性化し、すべての細胞培養皿から細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに集めた。癌細胞を計数するために、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルの0.4%トリパンブルー染色に加える。
数回上下にピペッティングしてサンプルを混合した後、チャンバーあたり10マイクロリットルの細胞混合物をセルカウンター内のサンプルスライドにロードする。次に、正しい容積の細胞培養懸濁液を50ミリリットルのチューブに500倍Gで5分間遠心分離する。上清を捨てた後、細胞ペレットを1ミリリットルのコラーゲンRPMIミックスと混合する。
細胞を1ミリリットルのピペットと混合したら、調製した細胞懸濁液を氷上に保管する。孵化10日目に、孵化した殻のない卵を入れた内部加湿チャンバーをインキュベーターから取り出します。内部加湿チャンバーを開けた後、滅菌された鉗子を使用してCAM上に最大6つのシリコーンリングを置きます。
癌細胞懸濁液をピペッティングによって混合して癌細胞の均一な分布を得たら、調製した癌細胞懸濁液をシリコーンリングの内側に20マイクロリットル加える。内部の加湿チャンバーを閉じた後、卵インキュベーターに入れます。14時間、1.5日、2.5日、および3.5日のインキュベーションの後、蓋を1つずつ開きながら、約7つの内部加湿チャンバーを取り出します。
一対のはさみで、シリコーンリングの外側に切断してCAMに結合した培養癌細胞を解剖する。次いで、単離されたCAM-Delamサンプルを鉗子を用いて直ちにペトリ皿中の0.1モルリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒドに移し、組織の固定のために氷上または摂氏4度で1時間保持する。次に、4%パラホルムアルデヒド溶液を除去し、0.1モルリン酸緩衝液中の30%スクロースをCAM-Delamサンプルに加え、摂氏4度で1時間平衡化する。
解剖顕微鏡下で、鉗子を使用してシリコーンリングを慎重に取り外す。次に、一対のはさみを用いてCAM-Delamサンプルを中央に癌細胞を持たせた長方形に切断する。次いで、CAM-Delamサンプルをシャーレ内の凍結切片培地に移して余分なスクロースを除去し、次いで一対の鉗子を用いて凍結切片培地にカビを包埋した。
解剖顕微鏡下で、任意の針状の器具を使用して、埋め込み型に垂直反応でU字型のCAM-Deramサンプルを配置し、CAM-Delamサンプルを摂氏80度で保存します。次に、凍結切除を使用して、凍結したCAM-Delamサンプルを5〜6枚の連続したスライドで10マイクロメートルで切断します。まず、セクションが終了するスライドに疎水性マーカーで線を作り、数分間乾燥させます。
次いで、スライドを加湿チャンバーに入れ、約200〜500マイクロリットルのブロッキング溶液で切片を覆い、15〜30分間インキュベートする。ブロッキング溶液を流し込んだ後、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体100〜150マイクロリットルと交換し、摂氏4度で一晩インキュベートする。同様に、一次抗体溶液を注ぎ落とした後、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3回洗浄する。
次に、スライドから、および疎水性バリア領域から、軟紙組織で過剰なTBSTを除去し、DAPIと組み合わせたブロッキング溶液で希釈した100〜150マイクロリットルの適切な二次蛍光抗体でスライドを覆う。スライドを室温で暗所で1時間インキュベートする。二次抗体溶液を注ぎ落とした後、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3回洗浄する。
その後、スライドから、および柔らかい紙組織で疎水性バリア領域から余分なTBSTを除去します。次に、スライドに蛍光マウント媒体を1~2滴入れてスライドをマウントし、気泡を避けながらガラスカバースリップをそっと置きます。デジタルカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡を用いて切片を、好ましくは10倍の倍率で撮影し、原稿に記載されているように、以下のCAM-Delamスコアリングカテゴリを使用して切片を分析する。
内部加湿チャンバーの使用は、ニワトリ胚の生存率を、孵化10日目で50%未満から90%まで、および孵化13日目に約15%から80%まで有意に改善した。この結果は、がん細胞が基底薄層を分解して間葉系に侵入する能力は、目に見える変化のない無傷の基底薄層、変化しているが損傷を受けていない基底薄層、細胞浸潤のない損傷基底薄層、および細胞浸潤を伴う損傷基底薄層を含む4つのカテゴリーにスコアリングできることを示した。フォン・ヴィルブラント因子に対する抗体染色は、癌細胞が基底薄層の変化または損傷を引き起こしたときに、CAMが血管形成の増加とともに肥厚したことを示している。
しかしながら、CAMが無傷であった場合、これら2つの表現型のいずれも観察されなかった。PC-3U細胞は、1.5日後に損傷ラミニンを誘導し、2.5日後には明らかな浸潤を伴った。対照的に、U251細胞は1.5〜3.5日後にラミニンのわずかな変化を誘導しただけで、ラミニンに目に見える損傷を引き起こすことはなかった。
塩化コバルト処理後、U251非転移性癌細胞は層間剥離および浸潤性細胞を誘導する能力を獲得し、MMP阻害剤GM6001と併用すると抑制された。このような膜の損傷はアッセイの読み出しを破壊することになるので癌細胞を播種するときにピペットチップでCAMを損傷させない。将来の可能性は、CAM-Delam法を最適化して臨床腫瘍サンプル中の転移特性を決定することであり、これは将来、今日使用されている腫瘍結節転移ステージングを補完する可能性がある。
