CAM-Delam测定通过量化癌细胞的分层和侵袭能力来评分转移特性

该方法可视化和量化癌细胞分层和侵入的能力，从而能够在作用形成或转移之前评估其转移性侵袭性。评分基于分层过程作为转移形成的先决条件，从而以相对快速，简单和廉价的方式获得有关细胞转移侵袭性的信息。在开始实际实验之前，请先练习不同的各个步骤。

CAM-Delam测定包括几个技术步骤，这些步骤很难用书面形式解释，并且更容易通过视觉演示来欣赏和学习。首先，将所需数量的鸡蛋放入鸡蛋托盘中，并在鸡蛋孵化器中水平孵化雏鸡鸡蛋。然后喷洒70%乙醇对30个称重船和30个带有透明盖的小塑料盒进行灭菌。

接下来，在层流罩中干燥称量船和盒子过夜，并储存在封闭的塑料盒中，直到在孵育第三天进一步使用。对每30个孵化鸡蛋，两对剪刀和三对镊子进行两升蒸馏水或去离子水的消毒。首先，在灭菌塑料盒中加入约50毫升的无菌水并合上盖子。

在孵化第三天，用剪刀的锋利部分打碎蛋壳，并在蛋壳上切一个直开的口。在称量船上手动打开蛋壳后，收集蛋清，蛋黄，并将其附着在称重船上的健康胚胎。然后寻找一个完整的胚胎，心脏跳动，卵黄完整，并为实验发育血管。

接下来，将称量船轻轻转移到内部加湿室中，并在种蛋孵化器中孵育内部加湿室。为了制备硅胶环，将内径和外径分别为四毫米和五毫米的硅胶管切割成约一毫米的厚度，优选使用切纸机。然后将硅胶环转移到小玻璃瓶上。

用金属箔覆盖它们，并使用高压灭菌器或类似物进行灭菌。将无菌硅胶环存放在室温下。在细胞培养的相关培养基中培养感兴趣的癌细胞系。

然后准备一毫升胶原蛋白RPMI混合物并将其保存在冰上。接下来，胰蛋白酶消化癌细胞，首先取出细胞培养基并洗涤以分离细胞。然后每15厘米直径的细胞培养皿中加入三毫升胰蛋白酶溶液，并在细胞培养箱中孵育两到三分钟，直到细胞分离。

使用台式倒置显微镜，观察分离的细胞。然后通过向每个细胞培养皿中加入五毫升完整的RPMI培养基来灭活胰蛋白酶，并将所有细胞培养皿中的细胞悬浮液收集到50毫升管中。要计数癌细胞，将10微升细胞悬浮液加入10微升0.4%台盼蓝染色剂中。

通过上下移液几次混合样品后，每个腔室将10微升的细胞混合物加载到细胞计数器中的样品载玻片中。接下来，在50毫升管中以500倍G离心正确体积的细胞培养悬浮液5分钟。丢弃上清液后，将细胞沉淀与一毫升胶原蛋白RPMI混合物混合。

一旦将细胞与一毫升移液管混合，将准备好的细胞悬浮液保持在冰上。在孵化日10，从孵化器中取出内部加湿室和孵化的无壳蛋。打开内部加湿室后，使用灭菌镊子在凸轮上放置最多六个硅胶环。

一旦通过移液混合癌细胞悬浮液以获得均匀分布的癌细胞，在硅胶环内加入20微升制备的癌细胞悬浮液。关闭内部加湿室后，将其放入种蛋孵化器中。在14小时，1.5天，2.5天和3.5天的孵育后，取出大约七个内部加湿室，同时一次打开一个盖子。

用一把剪刀，通过切割硅胶环外来解剖附着在CAM上的培养的癌细胞。然后立即使用镊子将分离的CAM-Delam样品转移到培养皿中0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中以固定组织并保持在冰上或4摄氏度下一小时。接下来，除去4%多聚甲醛溶液，并在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中加入30%蔗糖到CAM-Delam样品中，并在4摄氏度下平衡一小时。

在解剖显微镜下，使用镊子小心地取下硅胶环。接下来，使用一把剪刀将CAM-Delam样品切成矩形，中间有癌细胞。然后将CAM-Delam样品转移到培养皿中的冷冻切片培养基中以除去多余的蔗糖，然后用一对镊子将模具包埋在冷冻切片培养基中。

在解剖显微镜下，使用任何针状仪器在包埋模具中垂直反应中将CAM-Delam样品定位为U形，并将CAM-Delam样品储存在80摄氏度。然后使用冷冻切片将冷冻的CAM-Delam样品以10微米切分在五到六个连续的载玻片上。首先，在切片结束的载玻片上用疏水标记做一条线，让它们干燥几分钟。

然后将载玻片置于加湿室中，并用约200至500微升的封闭溶液覆盖切片，并孵育15至30分钟。倒出封闭溶液后，用100至150微升在封闭溶液中稀释的感兴趣的一抗代替，并在四摄氏度下孵育过夜。同样，倒出一抗溶液后，将载玻片转移到玻璃比色皿中，并在TBST中洗涤至少三次，每次五分钟。

接下来，用软纸巾从载玻片和疏水屏障区域除去多余的TBST，并用100至150微升合适的二级荧光抗体覆盖载玻片，该二级荧光抗体在封闭溶液中稀释与DAPI组合。在室温下在黑暗中孵育载玻片一小时。倒出二抗溶液后，将载玻片转移到玻璃比色皿中，并在TBST中洗涤至少三次，每次清洗五分钟。

然后用软纸巾从载玻片和疏水屏障区域除去多余的TBST。接下来，通过在载玻片上滴一到两滴荧光安装介质来安装载玻片，并轻轻放置玻璃盖玻片，同时避免气泡。使用配备数码相机的落射荧光显微镜拍摄切片，最好以10倍放大倍率拍摄切片，并使用以下CAM-Delam评分类别分析切片，如手稿中所述。

使用内部加湿室显着提高了雏鸡胚胎的存活率，从孵育第10天的不到50%提高到90%，在孵育第13天从大约15%提高到80%。结果表明，癌细胞降解基底层和侵入间充质的能力可分为4类，包括无明显改变的完整基底层、改变但未受损的基底层、无细胞侵袭的基底层和受损的基底层伴细胞侵袭。针对von Willebrand因子的抗体染色表明，当癌细胞引起基底板改变或受损时，CAM也会随着血管形成的增加而增厚。

然而，当CAM完好无损时，没有观察到这两种表型。PC-3U细胞在1.5天后诱导损伤的层粘连蛋白，2.5天后诱导透明浸润。相比之下，U251细胞仅在1.5至3.5天后诱导层粘连蛋白的微小改变，但从未对层粘连蛋白造成任何可见的损伤。

氯化钴治疗后，U251非转移性癌细胞获得了诱导分层和侵袭细胞的能力，当与MMP抑制剂GM6001组合时，这些细胞被抑制。在接种癌细胞时，不要用移液器尖端损坏CAM，因为膜的这种损伤会破坏测定的读数。未来的可能性是优化CAM-Delam方法以确定临床肿瘤样品中的转移特性，这未来可以补充当今使用的肿瘤淋巴结转移分期。