細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

小胞の細胞形成へのエンドサイトーシスは、細胞内小胞の形成をもたらす。小胞の透過処理は様々なシグナル経路を活性化する。発色団支援レーザー不活性化は、細胞内小胞破裂の結果を研究するために使用されます。

細胞内小胞に対する細胞内損傷の空間的および時間的制御は、静置状態および光照明を調整することによって達成することができる。まず、HeLa細胞培養を10%FBSを添加したDMEMで維持します。細胞をPBSで洗浄した後、細胞をトリプシン処理します。

次に、10%FBSを添加したDMEMで細胞を再懸濁します。300ナノグラムのGal3-GFPプラスミドを25マイクロリットルの還元血清培地で希釈する。次に、0.6マイクロリットルのP3000試薬を追加します。

そして穏やかに混合し、続いて溶液をボルテックスする。0.45マイクロリットルのリポフェクタミン3000試薬を25マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。

次に、希釈したDNAと希釈したリポフェクタミン3000を混合し、室温で10分間インキュベートします。DNAリポフェクタミン混合物を混合した後、300, 000個のHeLa細胞と200マイクロリットルのDMEMを10%FBSと混合し、35ミリメートルのガラスボタン皿の中央ガラス領域に細胞を播種します。細胞を付着させるには、5%二酸化炭素を供給されたインキュベーター内で摂氏37度で細胞を少なくとも4時間インキュベートします。

10%FBSを添加したDMEMでAlPcS2aを希釈して、1マイクロモルのAlPcS2a溶液を作製します。AlPcS2a含有培地を摂氏37度のウォーターバスで予熱し、培養培地をAlPcS2a含有培地と交換します。5%二酸化炭素を供給したインキュベーター内で摂氏37度で細胞を一晩インキュベートします。

翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、培地を新鮮な培地に交換した後、細胞外AlPcS2aを除去した。摂氏37度で4時間インキュベートし、エンドサイトーシス経路に沿った残留色素がリソソームに蓄積できるようにします。リソソームを損傷して単一細胞を操作するには、共焦点顕微鏡のステージに培養皿を置きます。

GFPとAlPcS2aを励起するには、それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用します。損傷するように選択されたAlPcS2a標識小胞上の5×5マイクロメートル四方の関心領域を丸で囲みます。次に、0.21ミリワットの633ナノメートルレーザー、つまり70回の繰り返しで関心領域をパルス照明します。

リソソーム膜透過処理の指標としてGal3プンクタの形成を監視する。HeLa細胞におけるAlPcS2aによるリソソーム染色は市販のマーカーを用いて行い、緑色蛍光色素で陽性染色した。TagRFP-ガレクチン3発現HeLa細胞中のリソソームをAlPcS2aで染色した。

近赤外光で照明を集束させた後、結果は、AlPcS2aベースの発色団支援レーザー不活性化が、関心のある領域内の局所的なリソソーム破裂を制御し、残りのリソソームを無傷のままにすることができることを示しています。インキュベーション時間が立っているエンドソームまたはリソソームを決定するため、このステップは重要です。例えば、人々は膜不透過性色素の放出によってサイズを決定することができる。

また、FITCデキストランなどのpH感受性色素を使用して、エンドソームとリソソームを区別することもできます。この技術は、細胞内小胞膜破裂の下流効果を開始するのに有用である。そして、さまざまな状況下で下流の影響があります。