Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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この作品は、技術革新 (CFI) のアルバータ大学学部医学と歯学、友人のギャレット カミング研究椅子基金、HM のトゥーピン神経科学研究の椅子基金、筋ジストロフィー カナダ、カナダの財団によって支えられました。アルバータ州の高度な教育と技術 (AET)、カナダ保健研究 (機構)、ジェシーの旅 - 遺伝子と細胞療法、女性と子供の健康研究所 (WCHRI) のための基礎機構とアルバータ州革新健康ソリューション (AIHS).
博士スティーブン ラヴァルをありがとうフルレングス ジスフェリン プラスミドをご提供したいと思います。技術的助言の Katsuya Miyake 先生に感謝も申し上げます。

本研究で使用されるひと線維芽細胞は、医学部・歯学部アルバータ大学で人間の倫理委員会から承認を得て使用されました。
1. フルレングスの DYSF プラスミドを細胞のトランスフェクション
<ol>
	<li>成長媒体 - 36 mL ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS) の 4 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) - 37 ° C で CO2インキュベーターの 20 μ L の 40 mL を含む T225 フラスコ培養線維芽細胞 注: セルは約 70-80% の confluency に培養する必要があり、なって完全に合流するべきではないです。</li>
	<li>シードの細胞を準備をするには、40 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のセルを 2 回、リンス セルをデタッチする 0.05% トリプシンの 5 mL を追加します。37 ° c CO2インキュベーターのセルを返すし、5 分のセルを孵化させなさい。<ol>
		<li>セルは完全に独立した、トリプシン反応を停止する成長媒体の 40 mL を追加します。</li>
		<li>診断を使用してセルまたはデバイスを数える別のセルをカウントします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>35 mm コラーゲン被覆ガラス底皿に5セル/mL の 1 x 10 のセルの 2 mL をシードします。37 ° C で CO2インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注: セルする約 50-60% 合流次の日する必要があります。</li>
	<li>成長媒体を取り外して 2 ml の血清を奪われたメディア (FBS なし成長媒体)。</li>
	<li>フルレングス ジスフェリン プラスミド lipotransfection を使用してセルを transfect します。<ol>
		<li>1.5 mL チューブ (トランスフェクションするのに各料理の 1 つの管) の血清を奪われたメディアの 150 μ L を準備します。</li>
		<li>血清を奪われたメディアを含む各 1.5 mL チューブにトランスフェクション試薬の 3 μ L を追加します。それは室温で少なくとも 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>別 1.5 mL チューブに 175 μ L の血清を奪われたメディアとプラスミド DNA の 3.5 μ g を追加します。 注: は、トランスフェクションするのに各追加料理の上記金額を乗算します。</li>
		<li>150 μ L の血清を奪われたメディアとトランスフェクション試薬の 150 μ L でチューブにプラスミド DNA を含むメディアを組み合わせます。室温で 20 分間インキュベートそれ。</li>
		<li>プラスミド、トランスフェクション試薬とメディアの 300 μ L を料理に均等に分散します。37 ° C で CO2インキュベーターで 24 h の料理を孵化させなさい</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清を含む新鮮な成長媒体でメディアを交換し、37 ° C で CO2インキュベーターでさらに 24 時間インキュベート</li>
</ol>
2 セルの 2 光子負傷試金のための準備
<ol>
	<li>ピペッティングでメディアを削除、タイロード溶液 1 mL と 1 回細胞を洗浄し、2.5 ミリメートル FM の 1 μ L を含む新鮮なタイロード溶液の 1 mL を追加 4 64 染料。 注: FM 4-64 の染料の最終濃度は 2.5 μ M です。</li>
	<li>カルシウムの欠乏した環境で細胞膜修復の評価が必要な場合は、1 ml の PBS のセルをすすいで 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸を含む PBS の 1 つの mL を追加します。 注: PBS は、細胞が時間の経過を切断すると負傷のアッセイは、できるだけ早く完了する必要があります。</li>
</ol>
3. 2 光子レーザー負傷アッセイ
<ol>
	<li>倒立の共焦点顕微鏡と関連付けられたプログラム ソフトウェアを使用して、0.2 μ x 2 μ m ターゲットを作成し、細胞膜の端にそれを置き、ターゲット ラインと重なるし、細胞膜 (図 2) の方向に垂直であります。</li>
	<li>FM 色素信号を励起し、600-760 nm の検出範囲の設定 543 nm HeNe レーザーを使用します。GFP 信号 (図 4) をエキサイト 500 550 nm の検出範囲を設定し、488 nm アルゴン レーザーを使用します。<ol>
		<li>作成の 5 分の時系列連続画像スキャン、イメージ投射セルのすべての 5 s。</li>
		<li>膜病変を生成するには、820 nm、15% を使用してに設定 2 光子レーザーを用いた漂白剤細胞はレーザ 10 の反復処理で出力と時系列の初めの後細胞 25 s をブリーチします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FM 4-64 色素蛍光を定量化するには、ソフトウェアを使用して、利益 (率 ROI) の 6 μ x 6 μ m 領域を描画し、負傷の場所と (図 3) のセル内に配置。 注: ソフトウェアで-このアプリケーションで「範囲インジケーター」関数を使用してピクセル過飽和のサンプリング エリアを避けるために、赤いピクセルは、過飽和ピクセルを表します。統計分析のための電子スプレッドシートに未加工の蛍光値をエクスポートします。</li>
	<li>(膜を傷つける前に縦長の平均蛍光値) バック グラウンド値を減算して各時点の相対的な蛍光値を計算し、t 増加額を割って、蛍光値 = 0 (図 5, 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo.">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Repair:+Mechanisms+and+Pathophysiology.">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li><li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+free+Ca2++and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells.">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li><li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair.">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage.">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li><li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury.">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li><li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi/beige+cells.">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li><li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses.">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos:+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo.">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair.">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li><li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy.">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li><li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li><li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

2 光子レーザーの細胞膜の負傷は、再シールする体外膜のダイナミクスを評価するため正確で汎用性の高い手法です。この記事で dysferlinopathy 患者細胞アッセイが負傷した二光子励起レーザーを使用しての能力を再シールする細胞膜を決定するプロトコルについて述べる。Dysferlinopathy 患者の細胞は細胞膜が再シールに欠陥が他の研究者による調査結果に一貫しているし、筋肉間の原動?...

真核細胞の細胞膜は、細胞の内か細胞外の環境を定義し、細胞の恒常性と細胞の生存を維持するために不可欠ですタンパク質がちりばめられたリン脂質の二重層で構成されます。機械的又は化学的侮辱から生じる細胞膜損傷、様々 な哺乳類の細胞のタイプで平凡、骨格を含む、心筋、胃、肺細胞は1,2,3,4。毎日生理機能の結果としての傷害、に加えては、環境の侮辱、細菌毒素、虚血再灌流5によって細胞膜を破損ことができます。細胞膜の破裂を再シールに失敗につながる細胞外 Ca2 +- - その他の潜在的に有害細胞コンポーネントと共に無秩序な流入、細胞へ細胞になることができますすぐに下流の信号カスケードをトリガー死1,4,5,6。
日には、細胞膜修復のためいくつかの提案されたモデルがずっとあります。サイズや膜破裂の性質に応じて異なる修復メカニズムが起動できます。たとえば、側方流動や目詰まり小さな混乱を修復するタンパク質が細胞膜を利用することが示唆された (&#60; 1 nm)。側面の融合モデルを提案する膜が破裂するがジスフェリン含む横募集を通して出される急速に膜7、蛋白質モデルの目詰まり小さな穿孔がタンパク質集計を出されることを示唆しています。(大抵アネキシン)8します。 逆に、大きい膜病変を引き起こす Ca2 +-依存、ジスフェリンを介した小胞融合し修復パッチの形成。修理パッチ モデルでセルに急速な Ca2 +流入トリガー形複合体や細胞内小胞の融合と共に「パッチ」複数のタンパク質 (ジスフェリン、アネキシン、mitsugumin-53、EDH 蛋白質) の募集やリソソーム膜のサイトで4,9,10、11,12に損傷を与えます。これらのモデルは必ずしも相互に排他的ではありませんし、膜の修復を容易にするコンサートで動作可能性がありますに注意してくださいすることが重要です。細胞膜の損傷を正しく再シールに失敗した筋ジストロフィー (dysferlinopathy - 三好ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィーのタイプ IIB、前方脛骨発症型ミオパチーなど) を含む複数の病気の状態に関連付けられています。13、心筋症の14、および Chediak-東症候群 (CHS)15。
その適切な細胞膜の完全性と演劇を再シール健康と病気、そのような重要な役割細胞膜修復の分子機構の解明理解有益となる新しい治療戦略の検索で。したがって、速度を監視し、細胞膜修復の能力を評価する適切な実験技術を保有する必要は。細胞膜修復をモデル化するためいくつかの培養方法を設計されています。1 つの戦略には、機械的損傷、細胞をこするピペット/手術/刃またはセル16のガラスビーズの寝返りによってを通じて促進することができますが含まれます。ただし、機械的損傷のこのタイプはより大きな病変を生成し、細胞損傷、内や文化の間の変化の高度を作成します。
膜の傷を生成する別の方法は、二光子励起顕微鏡法によるレーザーアブレーションです。単一光子励起を採用し従来のレーザー共焦点顕微鏡と対照をなして 2 光子レーザーは同時に17の高エネルギー電子の励起を容易にするのに 2 つの長波長、低エネルギーの光子を使用します。この非線形プロセス結果励起焦点面でのみ、全体の光路17 (図 1) にはないです。これは、削減励起ボリューム イメージングの生きているセル18,19時に光損傷を最小限に抑えることです。研究者は、細胞膜とモニター膜は蛍光染料を使用し、細胞膜が破裂し、reseals としての蛍光強度の変化を観察することによってリアルタイムで再封止の正確な病変を生成することが従って。
このアプローチは、 in vitroとin vivoが負傷した膜を研究に使用されました、複数セルのタイプ20,21。たとえば、膜は、線維芽細胞および dysferlinopathy この技術22,23を行った患者由来細胞の欠陥を修復します。また、マウスから隔離された単一の筋線維は、修復パッチ形成13,24,25を監視する使用されました。9単一の筋線維の細胞膜修復中の蛍光付けられた蛋白質の動きを観察することも。さらに、ゼブラフィッシュ胚における二光子励起レーザーが負傷した後, 修復のプロセスは、26リアルタイム体内で観察できます。
この記事で私たちは能力を再封止膜の定量化を目的として様々 な細胞タイプにこの方法論を適用できますが、2 光子レーザーの負傷を使用して線維芽細胞細胞膜修復の動態を評価するための方法論を概説します。生体外で。FM4 64 セルに孵化するこの方法では、すぐに否定的に連結され、蛍光を発する脂溶性、細胞不浸透性染料の帯電膜病変から細胞に入ると細胞質内リン脂質 (図 2&#38;3). 色素蛍光膜病変に隣接の定量化により細胞膜自体を封印するためにかかる時間を監視するため。このメソッドの有用性を実証するため細胞膜修復の救助を評価するのに GFP 共役フルレングス ジスフェリン (DYSF) プラスミドをトランスフェクトした dysferlinopathy 患者線維芽を使用します。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Serum-deprived media</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s Salts Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Two-photon laser</td><td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

数多くの病態生理学的侮辱は細胞膜に損傷を与えることができるし、細胞膜修復または整合性の生来欠陥と相まって病で発生する可能性が。周囲の細胞膜修復基盤となる分子機構の解明は、したがって、機能不全の細胞膜の動態と関連する疾患の新規治療戦略の開発に重要な目的。細胞膜を再シールするさまざまな疾患のコンテキストで理解することを目的とした多くのin vitroとin vivoの研究は、次の実験的治療機能の結果を決定するための標準として 2 光子レーザー焼灼を利用します。この分析では、細胞膜が破裂し、細胞に侵入する蛍光色素細胞膜をおこす二光子励起レーザーと負傷にさらされます。セル内での蛍光の強度は、自体を再シールする細胞の能力を定量化する監視できます。アプローチ自体が負傷した二光子レーザーで大きな変化と同様、傷害、細胞膜の応答を評価するためのいくつかの方法があります、したがって、セルが負傷したの単一の統一されたモデルは有益減少になるだろう、これらの方法のバリエーション。この記事では、細胞膜修復体外の両方の健康と dysferlinopathy 患者線維芽細胞細胞トランスフェクション フルレングス ジスフェリン プラスミドの有無を評価するためのプロトコルが負傷した単純な二光子励起レーザーを概説します。

健康な線維芽細胞、dysferlinopathy の非投与患者線維芽細胞、フルレングス ジスフェリン シーケンス機能を再封止膜を評価するために負傷した二光子レーザーを受けたを含むプラスミドをトランスフェクトした患者線維芽細胞リアルタイムで.正常ひと線維芽細胞がレーザーが負傷した FM 4-64 蛍光活性の低レベルを表示し、非投与患者線維芽細胞展示相対蛍光強度損傷の...

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Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

2 光子レーザーを介して細胞膜が負傷した膜を再シール能力評価に広く使われている方法で、複数の細胞のタイプに適用できます。ここでは、体外でライブ イメージング dysferlinopathy 2 光子レーザー アブレーション患者細胞の膜を再シールするためのプロトコルについて述べる.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K ビュー.  University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry. 2 光子レーザーを介して細胞膜が負傷した膜を再シール能力評価に広く使われている方法で、複数の細胞のタイプに適用できます。ここでは、体外でライブ イメージング dysferlinopathy 2 光子レーザー アブレーション患者細胞の膜を再シールするためのプロトコルについて述べる.

ビデオ: Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

遺伝学

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

生物学

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

免疫・感染学

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

プラズマ膜修復の研究のためのレーザー誘起熱プラズモニックパンクチャー

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. To prevent damage to the membrane, cells have developed efficient plasma membrane repair mechanisms. These&#160;repair mechanisms can be studied by combining confocal microscopy and nanoscale thermoplasmonics to identify and investigate the role of key proteins, such as annexins, involved in surface repair in living cells and membrane model systems.
The puncturing method employs a laser to induce highly localized heating upon nanoparticle irradiation. The use of near-infrared light minimizes phototoxicity in the biological sample, while the majority of the absorption takes place in the near-infrared resonant plasmonic nanoparticle. This thermoplasmonic method has been exploited for potential photothermal and biophysical research to enhance the understanding of intracellular mechanisms and cellular responses through vesicle and cell fusion studies. The approach has shown to be complementary to existing methods for membrane disruption, such as mechanically, chemically, or optically induced injuries, and provides a high level of control by inflicting extremely localized injuries. The extent of the injury is limited to the vicinity of the spherical nanoparticle, and no detrimental damage occurs along the beam path as opposed to pulsed lasers using different wavelengths. Despite certain limitations, such as the formation of nanobubbles, the thermoplasmonic method offers a unique tool for investigating cellular responses in plasma membrane repair in an almost native environment without compromising cell viability.
When integrated with confocal microscopy, the puncturing method can provide a mechanistic understanding of membrane dynamics in model membrane systems as well as quantitative information on protein responses to membrane damage, including protein recruitment and their biophysical function. Overall, the application of this method to reduced model systems can enhance our understanding of the intricate plasma membrane repair machinery in living cells.

著者スポットライト:革新的な熱プラズモニックパンクチャリングによる原形質膜修復メカニズムの探索 

The thermoplasmonic puncture method integrates confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles to study protein responses during plasma membrane repair in cells and giant unilamellar vesicles. The technique enables rapid and localized membrane puncture, allowing the identification of key proteins and their functional roles in the intricate plasma membrane repair machinery.

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

要約

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マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

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マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション