ブドウ糖の取り込みは、健康と病気を理解するための鍵です。グルコースは、人体の代謝および構造的要求において極めて重要な役割を果たし、調節において重要な役割を果たす。グルコースの細胞外測定により、栄養素や薬物に応答した異なる遺伝的背景の細胞、組織、および器官におけるグルコース取り込みの動態に関するハイスループットアッセイの開発が可能になります。
このアッセイは、糖尿病、癌、中枢神経系の変性疾患、肥満、およびグルコースと代謝のすべての疾患に対する治療法と栄養の発見のための貴重なツールとなるでしょう。アッセイでは、さまざまな組織や細胞培養の代謝特性に基づいて、飢餓と刺激の時間を調整する必要があります。培養3T3-L1マウス線維芽細胞を10〜6細胞にプレーティングし、20ミリリットルの培地1を296ウェルプレートで希釈した。
1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートし、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持することを保証する。培地を交換せずに摂氏37度のインキュベーターで、約70〜80%のコンフルエントになるまで48時間細胞を増殖させます。細胞を同じ培地で48時間培養することにより、細胞をコンフルエントで絶食状態に保ちます。
所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間に変化させる。96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントします。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。
96ウェルプレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。ウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートします。細胞タイプの刺激、および希望する絶食レベルに応じてインキュベーション時間を調整します。
シミュレーション条件ごとに8回の反復を使用します。そのため、シミュレーション条件ごとに1ミリリットルを用意してください。インスリンなしで7つのシミュレーション条件を使用します。
196ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0ミリグラムのFDグルコース。インスリンで7つの刺激条件を使用します。別の96ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0マイクログラムのFDグルコース。
刺激条件を調製するには、FDグルコース作動液1ミリリットルあたり5ミリグラムの1マイクロリットルと、グルコースフリーDMEM999マイクロリットルを希釈して、1ミリリットルの作動原液を得る。この作業ストック溶液を用いて、1〜2000、1〜5,000、1〜10,000、1〜25,000、1〜50,000、および1〜100,000のFDグルコースの妄想を調製して、1ミリリットルあたり2.5マイクログラム、1ミリリットルあたり1マイクログラム、1ミリリットルあたり0.2マイクログラム、1ミリリットルあたり0.1マイクログラム、 ライトのないバイオセーフティキャビネットでの実験の直前に、2ミリリットルのチューブでミリリットルあたり0.05マイクログラム。これらの各条件に1マイクロリットルのインスリンを追加します。
インキュベーションの40分後、各ウェルからのグルコース遊離DMEMを96ウェルプレートにデカントし、残りの流体を滅菌ペーパータオルで吸収する。前述のさまざまな処理条件からそれぞれ100マイクロリットルを1つのカラムに沿ってウェルに追加します。そして同じ処理条件から100マイクロリットルを96枚の壁面板の列に沿ったウェルにした。
インスリンの有無にかかわらず、条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェルに追加します。プレートを暗所の細胞培養インキュベーター内で40分間インキュベートします。
細胞を40分間刺激した後。刺激媒体を両方のプレートから新しい96ウェルプレートに移し、同じ実験レイアウトを維持します。細胞をPBSで洗浄します。
PBSを取り出し、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。プロテアーゼ阻害剤をラジオ免疫沈降アッセイバッファーに添加して、タンパク質を保護します。ラジオ免疫沈降アッセイを含むプレートをシェーカーに30分間入れます。
マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長の蛍光をそれぞれ485ナノメートルと535ナノメートルで測定します。まず細胞外FDグルコースを含む培地中で、次いでプレートを放射免疫沈降アッセイを用いて30分間インキュベーションの終了時に細胞をライズした。製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを実行します。
放射性免疫沈降アッセイ用細胞を含む各ウェルにおけるタンパク質濃度を定量化する。10マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイホモジネートを使用してタンパク質濃度を測定し、96ウェルプレートで測定の精度を高めるために三重にします。各96ウェルプレート上のサンプルと一緒に分析されたタンパク質標準物質に基づいてタンパク質を定量します。
採取した組織または臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または臓器を別々のウェルで処理します。1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。
組織または臓器を4, 000マイクロリットルのグルコースフリーDMEMを含む別の6つのウォールプレートに移し、2分間インキュベートします。2分後、組織を除去し、0.29ミリモルFDグルコース作業溶液を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6つのウェルプレートをFDグルコース作業溶液中で摂氏37度でインキュベートする。
0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に各ウェルから100マイクロリットルのFDグルコース作業溶液を収集し、収集した100マイクロリットルのFDグルコース作業溶液を96ウェルプレートに移して、細胞外FDグルコース枯渇の速度論を分析しました。収集の前後に振ってください。マイクロプレートリーダーを使用して、それぞれ485ナノメートルと535ナノメートルの発光波長での励起時の蛍光を測定します。
FDグルコースの細胞内取り込みにおける用量依存性は、インスリンの存在下で有意に増加した。インスリン刺激は、インスリン刺激なしのサンプルと比較して、細胞外FDグルコースレベルを有意に低下させた。FDグルコースの細胞外枯渇は、細胞内FDグルコース取り込みと同等の精度でグルコース取り込みの変化を測定することができる。
細胞外FDグルコースは、インキュベーションの120分の間に非刺激対照内臓脂肪において枯渇しなかった。対照的に、解剖前のインスリンまたはAAC2によるマウスの前処理は、それぞれ30分および60分の時間間隔内で細胞外FDグルコースの有意な枯渇をもたらした。細胞外FDグルコースは、インスリン刺激肝外植片では、非刺激肝外植片と比較して枯渇しなかった。
細胞外FDグルコースは時間依存的に有意に減少し、AAC2.22%で前処理した肝外植片は、60分のインキュベーション後に未処理の脳を含む細胞外培地でグルコースの枯渇が観察された。インスリン処置マウスからの脳と共にインキュベートされた培地は、FDグルコースの5%直線的減少を示した。AAC2刺激脳は、最初の20分間で細胞外FDグルコースの67.4%への大幅な急速な減少をもたらしました。
洗浄を伴う物質は、これらの培地の蛍光読み取りを妨げる可能性があるため、培地および/または臓器内の微量のグルコース、血液、または血清を除去するために特に重要です。血糖特性を有する遺伝子中の代謝産物の化合物のハイスループット同定、ならびにin vivo実験におけるそれらの作用のための最適条件を、標識FDグルコースおよびPETスキャンで検証し、特定の臓器におけるグルコース蓄積を確認することができた。血糖作用の発見のためのこの技術は、多数の代謝産物、治療薬またはそれらの組み合わせの欠失において有益であり、異なる器官におけるそれらの作用を強調する。
