ספיגת גלוקוז היא המפתח להבנת בריאות ומחלות. כמו גלוקוז ממלא תפקיד מרכזי בדרישות מטבוליות ומבניות בגוף האדם, כמו גם משחק תפקיד חיוני ברגולציה. המדידה החוץ-תאית של גלוקוז מאפשרת פיתוח של מבחני תפוקה גבוהה לקינטיקה של ספיגת גלוקוז בתאים, רקמות ואיברים בעלי רקע גנטי שונה בתגובה לחומרים מזינים או לתרופות.
בדיקה זו תהיה כלי רב ערך לגילוי טיפולים ותזונה לסוכרת, סרטן, מחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית, השמנת יתר, וכל מחלות הגלוקוז וחילוף החומרים. הבדיקה זקוקה להתאמת זמן לרעב וגירוי שצריכים להתבסס על פרטים מטבוליים עבור רקמות ותרביות תאים שונות. תרבית 3T3-L1 עכבר פיברובלסטים על ידי ציפוי 10 עד 6 תאים, מדולל ב 20 מיליליטר של בינוני 1 מתוך 296 לוחות באר.
צלחת 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר, הבטחת שמירה על הומוגניות של השעיה זו על ידי ערבוב. לגדל תאים במשך 48 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס מבלי להחליף מדיה עד כ-70% עד 80% מפגש. שמרו על תאים מתמזגים וצום על ידי גידולם באותו מדיום במשך 48 שעות.
יש לשנות את זמן הדגירה בין 24 ל-72 שעות, בהתאם למצב הקטבולי הרצוי. מדיה דקנטית מתאים ב-96 לוחות הבאר. סופגים את הנוזלים הנותרים באמצעות מגבות נייר סטריליות.
שטפו את צלחת 96 הבאר עם 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר, וספגו את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות. יש להוסיף 100 מיקרוליטרים של DMEM ללא גלוקוז לכל באר, ולדגור במשך 40 דקות. התאימו את זמן הדגירה בהתאם לגירויים של סוג התא, ולרמת הצום הרצויה.
השתמש בשמונה עותקים משוכפלים עבור כל תנאי סימולציה. לכן, הכינו מיליליטר אחד לכל תנאי סימולציה. השתמש בשבעה תנאי סימולציה ללא אינסולין.
FD גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר, ו-0 מיליגרם למיליליטר בצלחת 196. השתמש בשבעה מצבי גירוי עם אינסולין. FD גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר, ו-0 מיקרוגרם למיליליטר בצלחת באר אחרת של 96 באר.
כדי להכין תנאי גירוי, יש לדלל מיקרוליטר אחד של חמישה מיליגרם למיליליטר תמיסת עבודה של גלוקוז FD, ו-999 מיקרוליטרים של DMEM ללא גלוקוז כדי להשיג מיליליטר אחד של תמיסת מלאי עבודה. באמצעות פתרון מלאי עבודה זה, להכין 1 עד 2000, 1 עד 5, 000, 1 עד 10, 000, 1 עד 25, 000, 1 עד 50, 000, ו 1 עד 100, 000 אשליות של גלוקוז FD כדי להשיג 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, 1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, 0.1 מיקרוגרם למיליליטר, 0.05 מיקרוגרם למיליליטר בשני צינורות מיליליטר מיד לפני ניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות. הוסף מיקרוליטר אחד של אינסולין לכל אחד מהתנאים האלה.
לאחר 40 דקות של דגירה, יש לרוקן את ה-DMEM נטול הגלוקוז מכל באר ב-96 צלחות באר, ולספוג את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות. הוסף 100 מיקרוליטרים כל אחד ממצבי הטיפול השונים שתוארו קודם, לבארות לאורך עמודה אחת. ו-100 מיקרוליטרים מאותו מצב טיפול לבארות לאורך השורה בשני לוחות הקיר.
תייג את הצלחות שניצלו את התנאים, עם ובלי אינסולין. יש להוסיף DMEM ללא גלוקוז בלבד לבארות הבקרה. לדגום את הצלחת במשך 40 דקות באינקובטור תרבית התאים בחושך.
לאחר התאים כבר מגורה במשך 40 דקות. העבירו את מדיית הגירוי משני הלוחות ל-96 לוחות קידוח חדשים, תוך שמירה על אותה פריסה ניסיונית. לשטוף את התאים עם PBS.
הסר PBS ו decant כל פתרון שנותר על מגבות נייר סטריליות. הוסיפו מעכב פרוטאז למאגר בדיקת מיצוי חיסוני ברדיו כדי להגן על החלבונים. הניחו צלחות המכילות בדיקת מיצוי חיסוני ברדיו בשייקר למשך 30 דקות.
באמצעות קורא מיקרו-לוחות, מדוד פלואורסצנציה באורכי גל של עירור ופליטה ב-485 ו-535 ננומטר בהתאמה. תחילה בתווך המכיל גלוקוז FD חוץ-תאי, ולאחר מכן בצלחת עם בדיקת משקעים רדיו-אימונוספרציוניים התאים בסוף הדגירה של 30 דקות. בצע בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן.
לכמת את ריכוזי החלבונים בכל באר המכילה תאי בדיקה של מיצוי חיסוני ברדיו. השתמש ב-10 מיקרוליטרים של בדיקת מיצוי חיסוני רדיו הומוגנט, ומדדו את ריכוזי החלבונים, ושילשו כדי להגדיל את דיוק המדידות ב-96 לוחות באר. כימות חלבון על סמך תקני חלבון שנותחו יחד עם דגימות על כל צלחת באר 96.
דגירה של הרקמות או האיברים שנקטפו בצלחת של שש בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפל בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת. לאחר דקה אחת, הניחו כל רקמה על מגבת נייר סטרילית כדי לספוג PBS.
העבר רקמות או איברים בצלחת נפרדת של שישה קירות המכילה 4, 000 מיקרוליטר של DMEM ללא גלוקוז, ודגירה במשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, הסר והעבר את הרקמות לתוך בארות של צלחת שש בארות המכילה 0.29 מילימולר FD גלוקוז פתרון עבודה. דגירה של שש צלחות באר המכילות רקמות בתמיסת עבודה של גלוקוז FD בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
אסוף 100 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה של גלוקוז FD מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו -120 דקות של דגירה, והעבר אסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה של גלוקוז FD לתוך 96 צלחות באר כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף. מדוד את הפלואורסצנציה בעירור באורכי גל פליטה ב-485 ו-535 ננומטר בהתאמה באמצעות קורא מיקרו-לוחות.
התלות במינון בקליטה התוך-תאית של גלוקוז FD הוגברה באופן משמעותי בנוכחות אינסולין. גירוי האינסולין הוביל לירידה משמעותית ברמות הגלוקוז החוץ-תאי FD בהשוואה לדגימות ללא גירוי אינסולין. דלדול חוץ-תאי של גלוקוז FD יכול למדוד שינוי בספיגת הגלוקוז בדיוק דומה לזה של ספיגת גלוקוז FD תוך-תאית.
הגלוקוז החוץ-תאי FD לא התרוקן בשומן הקרביים הלא-מגורה במהלך 120 דקות של דגירה. לעומת זאת, טיפול מקדים בעכברים עם אינסולין או AAC2 לפני הנתיחה, הוביל לדלדול משמעותי של גלוקוז FD חוץ-תאי במרווח זמן של 30 דקות, ו-60 דקות בהתאמה. גלוקוז FD חוץ-תאי לא התרוקן ביציאות כבד מגורות אינסולין, בהשוואה לצמחי כבד שאינם מגורה.
רמת הגלוקוז החוץ-תאית FD פחתה באופן משמעותי באופן התלוי בזמן, והתפשטות הכבד שטופלה מראש ב-AAC2.22% דלדול של גלוקוז נצפתה בתווך החוץ-תאי המכיל את המוח הלא מטופל לאחר 60 דקות של דגירה. המדיום שהודגר עם מוחות מעכברים שטופלו באינסולין הראה ירידה ליניארית של 5% ברמת הגלוקוז FD. מוחות מעוררי AAC2 הובילו לירידה מהירה עמוקה ל-67.4% מהגלוקוז החוץ-תאי FD במהלך 20 הדקות הראשונות.
חומרים הכרוכים בשטיפה חשובים במיוחד להסרת עקבות של גלוקוז, דם או סרום בתוך מדיום, או איברים, מכיוון שהם יכולים להפריע לקריאה הפלואורסצנטית של מדיומים אלה. לאחר זיהוי תפוקה גבוהה של תרכובות של מטבוליטים בגנים בעלי תכונות גליקמיות, כמו גם התנאים האופטימליים לפעולתם בניסויי in vivo, ניתן לאמת באמצעות סוכר FD מסומן וסריקת PET כדי לאשר הצטברות גלוקוז באיברים ספציפיים. טכניקה זו לגילוי של פעולה גליקמית מועילה הן במחיקת מטבוליטים רבים, טיפולים או שילובים שלהם, ומדגישה את פעולותיהם באיברים שונים.
