インビトロで生分解性インプラント材料を研究するための直接的および間接的な培養方法。過去数十年にわたり、生分解性材料は、整形外科、歯科、頭蓋顎顔面インプラントなどの生物医学的用途のために広く探求されてきました。生物医学的用途のために生分解性材料をスクリーニングするためには、これらの材料をin vitro細胞応答、細胞適合性、および細胞毒性の観点から評価することが必要である。
国際標準化機構の規格は、生体材料の評価に広く利用されています。しかし、ほとんどのISO規格はもともと非分解性材料のスタイル毒性を評価するために設立されたため、生分解性材料のスクリーニングには限られた価値しか提供されていません。このビデオでは、生分解性インプラント材料のin vitro細胞適合性を評価するための直接培養法、直接暴露培養法、および暴露培養法の3つの異なる培養方法を紹介し、議論する。
具体的には、直接培養法は、新たに播種された細胞とインプラントとの間の相互作用を評価する。直接暴露培養は、体内の確立された細胞とインプラントとの間の相互作用を模倣する。暴露培養は、樹立された細胞とインプラントが互いに直接接触していないが、材料が分解する同じ環境にある場合の相互作用を特徴付ける。
このビデオでは、生分解性インプラント材料のin vitro細胞適合性および骨髄由来間葉系幹細胞との相互作用を研究するために、これら3つの培養方法を使用する例を提供します。このビデオで説明されているin vitro方法は、in vivo環境のさまざまなシナリオを模倣し、さまざまな生物医学的用途に対するさまざまな材料のin vitro細胞適合性試験の適用性と関連性を広げます。私たちは、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用コミュニティによって承認されたプロトコルに従って、細胞および組織の採取を行います。
細胞培養調製物。このビデオで説明されている 3 つの培養方法は、一般に、接着しているさまざまな細胞タイプに適用できます。ここでは、ラット離乳から採取したBMSCsを、ラット離乳期から骨髄由来間葉系幹細胞を採取する細胞培養調製の一例として紹介する。
この図の模式図は、ラット離乳からBMSCを収穫するステップを示す。皮膚および筋肉および結合組織を除去して、安楽死させたラットから大腿骨を解剖する。大腿骨を細胞培養培地を含む15mL円錐管に入れる。
細胞抽出を行う時点まで円錐形のチューブを氷の上に置く。骨を生物学的安全キャビネット内のペトリ皿に移す。手術用刃を用いて骨の端部を切断し、25 1/2ゲージ針の付いたシリンジを用いて骨髄腔を細胞培養培地で洗浄することにより、骨髄を50mL円錐管に流す。
70マイクロメートルのフィルターを用いて細胞懸濁液をろ過し、続いて重力126倍で5分間遠心分離を行い、細胞ペレットを取り出し、上清培地を吸引し、10mLの新鮮な培地を補充する。穏やかにピペットを上下させ、10mL血清学的ピペットを用いて細胞を再懸濁する。懸濁液をT-75フラスコの内側の底に直接ピペットで留め、媒体を加えて体積を最大25ミリリットルにします。
細胞を37°Cである標準的な滅菌細胞培養環境、5%二酸化炭素および95%空気で加湿雰囲気中の培養器で培養する。3〜7日後、古い培地を吸引し、新鮮な培地を補充することによって、非接着細胞を洗い流す。細胞の継代、凍結、または実験での使用の準備が整うまで、細胞を培養し、新鮮な培地で細胞を供給し続けます。
サンプル調製および滅菌。細胞培養の前にすべてのサンプルを滅菌または消毒する。異なるサンプルタイプの滅菌または消毒方法は、材料の異なる特性に応じて異なる。
一般に、in vitro研究のために生分解性金属を消毒するために紫外線を使用する。細胞培養方法。この図の模式図は、直接培養法の各工程を示している。
このビデオでは、BMSCsを12穴組織培養処理プレートのウェルの内部に配置したマグネシウム由来プレート上で培養し、その培養方法を例示する。90%コンフルエントフラスコを使用して、血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞濃度を決定した。新鮮な培地を使用して細胞懸濁液を、インビトロでの細胞研究に必要な所定の細胞濃度に希釈する。
サンプルを12穴組織培養プレートの中央に配置する。培養プレートを2 mLのPBSおよび2 mLのDMEMで順次すすぎ、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3mLを目的のサンプル上の各ウェルに加える。
細胞をインキュベーター内で標準的な細胞培養条件下で24時間培養する。図中の模式図は、直接暴露培養の工程を示す。異なる細胞タイプおよび意図された用途のための実験計画に基づいて、必要な濃度の細胞を有する細胞懸濁液を調製する。
培養プレートを2 mLのPBSおよび2 mLのDMEMで順次すすぎ、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3 mLを各ウェルに加える。標準的な細胞培養条件下で加湿インキュベーター内で細胞を24時間、または細胞が50%〜80%コンフルエントに達するまで培養する。
24時間リンス後、ウェルプレート内の細胞をPBSでピペットを用いて、浮遊死細胞を除去した。消毒または滅菌したサンプルを接着細胞に直接置きます。3 mL の新鮮な培地を各ウェルに加えます。
細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。この図の模式図は、露光培養法の工程を示す。細胞調製のための初期ステップは、直接暴露培養と同じである。
その後、膜孔径が0.4マイクロメートルのウェルインサートにサンプルを入れ、サンプルを含むウェルインサートを細胞のある各ウェルに入れます。細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。細胞の培養後特性評価。
直接培養および直接暴露培養の場合、ウェルプレートおよびサンプルの両方に付着した細胞を固定、染色、画像化および分析する。暴露培養のために、ウェルプレートに接着した細胞を分析する。各ウェルから後培養培地を対応する15mL円錐管に集め、さらなる分析を行う。
さらなる分析のために培養後のすべてのサンプルを収集します。サンプルおよびウェルプレートの両方に付着した細胞をPBSを用いて3回すすぎます。1mLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルプレートに加える。
蓋をウェルプレートに戻し、PFAを20分間反応させます。20分後、PFAを吸引し、廃棄物ボトルに分配する。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、PFAを除去し、廃棄物を廃棄物ボトルに移す。
製造元の指示に従って染色剤の作業ストックを準備します。希釈したAlexa Fluor 488ファロイジン染色剤200〜400マイクロリットルを各ウェルに加え、ウェルプレート上の細胞およびサンプルを覆う。ウェルプレートをアルミホイルで包んで光暴露を防ぎ、Alexa Fluor 488ファロイジンが室温で20分間反応できるようにします。
Alexa Fluor 488 ファロイジン染色剤を集め、対応する廃棄物ボトルに分配します。PBSを使用して壁板を3回すすぎ、余分なAlexa Fluor 488ファロイジンを除去し、使用済みのPBSを対応する廃棄物ボトルに分配します。200~400マイクロリットルの希釈DAPIを各ウェルに加え、ウェル内およびサンプル上の細胞を覆う。
ウェルプレートをアルミ箔で包み、DAPIを室温で5分間反応させます。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、使用済みPBSを対応する廃液ボトルに分注します。染色後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を画像化する。
可能な限り、蛍光画像に加えて細胞の位相差画像を撮影してください。生分解性サンプル上の細胞をできるだけ早く、または染色直後に画像化して、サンプルの連続的な分解によって引き起こされる可能性のある変化を回避または低減する。直接培養と直接露光培養の場合、2種類の細胞を画像化して評価する。
1つは、サンプル上の細胞がサンプルと直接接触し、2つは、図に示すようにサンプルと直接接触するサンプルを囲むウェルプレート上に細胞が接着した。ここに示すように、暴露培養では、細胞の蛍光画像を撮影するときに画像ガイドを使用して、サンプルの動的分解勾配に応答して細胞の応答が異なるかどうかを判断します。中心から3.5mm離れた内輪内の領域と、中心から7mm離れた外輪の領域にある細胞を別々に画像化して解析します。
各サンプルについて、および培養プレート内にいる間、細胞が予め定義された距離でサンプルと間接的に接触または間接的に接触している各関心領域から少なくとも5つの画像をランダムに撮影する。ステップ4.3から得られた全ての細胞画像から、画像解析のために細胞拡散面積及びアスペクト比を測定して細胞形態を定量化する。各画像領域のセル数を数えます。
直接・間接接触条件下での細胞接着密度を単位面積当たりの細胞数として算出する。培地およびサンプルの後培養分析。自己固定の前に、ポストカルチャーメディアを収集します。
収集直後の各ウェルにおける後培養培地のpH値を、予め較正されたpHメーターを用いて測定する。pH測定の前工程に続いて、イオン濃度の最適な測定のために望ましい希釈係数を使用して培地を収集して希釈します。ICP-OESと略称される誘導結合プラズマ発光分析装置を用いて培養後培地中の目的のイオンの濃度を測定する。
インビトロ細胞研究の後、生分解性サンプルは、寸法、質量、表面形態、微細構造、および組成において変化し得る。サンプルの培養後分析は、サンプルの分解メカニズムを理解するのに役立ちます。細胞培養後、サンプルの写真を撮って、サンプルの寸法、色、形態、およびその他の目に見える特性の可能な変化を示します。
培養後サンプルを乾燥または脱水し、サンプルの質量、寸法、および体積を測定して、質量、寸法、および体積の変化を定量化します。走査型電子顕微鏡を使用して、サンプルの微細構造と形態を特徴付けます。エネルギー分散型X線分光法とX線屈折を使用して、サンプル上の分解生成物の組成と相を特徴付けます。
FTIR または ATR を使用して、サンプル表面の化学結合を検出します。代表的な結果。ここで、図は、異なる培養方法を用いた直接的および間接的な接触条件下での骨髄由来幹細胞の代表的な蛍光画像を示す。
この図は、細胞接着密度を定量化するためのデータ例を示す。図Aに示すように、24時間の直接暴露培養において、ZC21と直接接触するBMSCは、他のどの群よりも有意に大きい細胞接着密度を有する。図Bに示すように、直接暴露培養の間接接触条件において、BMSC接着密度はマグネシウム群よりもZC21群に対して有意に高い。
しかしながら、対照群のみのT64および細胞と比較して有意差を示さない。ここで、図Aは、直接暴露培養及び直接培養後の後培養培地のpH値を示す。直接暴露培養の場合、培地のpH値はすべてのサンプルで8.3~8.4の範囲です。
直接培養では、培地のpH値はグループ全体で7.9〜8の範囲です。図Bは、後培養培地中のマグネシウムイオン濃度を示す。直接暴露培養および直接培養の両方において、ZC21およびマグネシウム群におけるそれらのマグネシウムイオン濃度は、他の対照群よりも有意に高い。
この図は、3日間の暴露培養後のZSr41および純マグネシウムについてのXRDパターンを示す。マグネシウム、酸化亜鉛、ハイドロキシアパタイトなどの異なる組成の結晶相が観察された。ここで、図Aは、酸化マグネシウム被覆マグネシウムの表面元素組成のSEM画像およびEDXマップのオーバーレイ、ならびにBMSCsによる直接培養の24時間後のマグネシウム基板およびガラスの対照を示す。
図Bは、試料表面の定量的表面元素組成を示し、細胞培養中に形成された異なる沈着を示す。結論。このビデオでは、さまざまな実験計画と意図されたアプリケーションに基づいて、生分解性インプラント材料の細胞適合性を評価するための3つの異なるin vitro方法を紹介しました。物質と様々な種類の細胞との相互作用を、直接培養法、直接暴露培養法、暴露培養法によって調べることができました。
このビデオでは、さまざまな医療用インプラント用途の細胞挙動に対する生分解性材料とその分解産物の影響を研究するための重要なin vitro方法を紹介しました。
