Metodi di coltura diretta e indiretta per lo studio di materiali implantari biodegradabili in vitro. Negli ultimi decenni, i materiali biodegradabili sono stati ampiamente esplorati per applicazioni biomediche, come impianti maxillo-facciali ortopedici, dentali e cranici. per vagliare i materiali biodegradabili per applicazioni biomediche, è necessario valutare questi materiali in termini di risposte cellulari in vitro, citocompatibilità e citotossicità.
Gli standard dell'Organizzazione internazionale per la standardizzazione sono stati ampiamente utilizzati nelle valutazioni dei biomateriali. Tuttavia, la maggior parte degli standard ISO sono stati originariamente stabiliti per valutare la tossicità di stile dei materiali non degradabili, fornendo così un valore limitato per lo screening dei materiali biodegradabili. In questo video, introdurremo e discuteremo tre diversi metodi di coltura, vale a dire, metodo di coltura diretta, metodo di coltura di esposizione diretta e metodo di coltura di esposizione per valutare la citocompatibilità in vitro di materiali implantari biodegradabili.
In particolare, il metodo di coltura diretta valuta le interazioni tra le cellule appena seminate e gli impianti. La coltura ad esposizione diretta imita le interazioni tra le cellule stabilite nel corpo e gli impianti. La coltura di esposizione caratterizza le interazioni tra le cellule stabilite e gli impianti quando non sono in contatto diretto tra loro ma nello stesso ambiente in cui i materiali si degradano.
Questo video fornisce esempi di utilizzo di questi tre metodi di coltura per studiare la citocompatibilità in vitro dei materiali implantari biodegradabili e le loro interazioni con le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo. I metodi in vitro descritti in questo video imitano diversi scenari dell'ambiente in vivo, ampliando l'applicabilità e la rilevanza dei test di citocompatibilità in vitro di diversi materiali per varie applicazioni biomediche. Seguiamo un protocollo approvato dalla Institutional Animal Care and Use Community dell'Università della California a Riverside per la raccolta di cellule e tessuti.
Preparazione della coltura cellulare. I tre metodi di coltura descritti in questo video sono generalmente applicabili a diversi tipi di cellule aderenti. Qui, le BMSC raccolte dallo svezzamento dei ratti saranno introdotte come esempio per la preparazione della coltura cellulare Raccolta di cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo da svezzamenti di ratto.
Il diagramma schematico in questa figura mostra i passaggi per raccogliere BMSC dallo svezzamento dei ratti. Rimuovere la pelle e i muscoli e i tessuti connettivi per sezionare il femore dal ratto eutanasizzato. Posizionare le ossa del femore in un tubo conico da 15 ml contenente terreni di coltura cellulare.
Posizionare i tubi conici sul ghiaccio fino al momento dell'esecuzione dell'estrazione cellulare. Trasferire le ossa in una capsula di Petri nell'armadio di sicurezza biologica. Tagliare le estremità dell'osso usando una lama chirurgica e lavare il midollo osseo in un tubo conico da 50 ml lavando la cavità del midollo osseo con terreni di coltura cellulare usando una siringa con l'ago calibro 25 1/2.
Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro da 70 micrometri seguito da centrifugazione a 126 volte la gravità per cinque minuti per ottenere i pellet cellulari Aspirare i mezzi surnatante e reintegrare con 10 ml di fluido fresco. Pipettare delicatamente su e giù per risospescere le celle usando una pipetta sierologica da 10 ml. Pipettare la sospensione direttamente sul fondo interno di un pallone T-75 e aggiungere un supporto per portare il volume a 25 millilitri.
Coltivare le cellule in un incubatore in un ambiente di coltura cellulare sterile standard di 37 gradi Celsius, atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Dopo tre o sette giorni, sciacquare via le cellule non aderenti aspirando ai vecchi media e reintegrando con mezzi freschi. Continuare a coltivare e nutrire le cellule con mezzi freschi fino a quando non sono pronte per il passaggio cellulare, il congelamento o l'uso in un esperimento.
Preparazione del campione e sterilizzazione. Sterilizzare o disinfettare tutti i campioni prima della coltura cellulare. I metodi di sterilizzazione o disinfezione per diversi tipi di campioni variano a seconda delle diverse proprietà dei materiali.
In generale, utilizzare le radiazioni ultraviolette per disinfettare i metalli biodegradabili per studi in vitro. Metodi di coltura cellulare. Il diagramma schematico in questa figura mostra i passaggi del metodo di coltura diretta.
In questo video le BMSC sono state coltivate su una piastra derivata dal magnesio posta all'interno dei pozzetti di una piastra trattata con coltura tissutale a 12 pozzetti come esempio per illustrare il metodo di coltura. Utilizzare un pallone confluente al 90% per determinare la concentrazione cellulare nella sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare utilizzando mezzi freschi a una concentrazione cellulare prescritta necessaria per lo studio cellulare in vitro.
Posizionare i campioni al centro delle piastre di coltura tissutale a 12 pozzetti. Risciacquare le piastre di coltura con 2 mL di PBS e 2 mL di DMEM in sequenza per calibrare la pressione osmotica in condizioni sterili. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto sui campioni di interesse.
Coltivare le cellule in un incubatore in condizioni di coltura cellulare standard per 24 ore. Il diagramma schematico in deturpazione mostra le fasi della cultura dell'esposizione diretta. Preparare la sospensione cellulare con le concentrazioni richieste di cellule in base al progetto sperimentale per diversi tipi di cellule e applicazioni previste.
Risciacquare le piastre di coltura con 2 mL di PBS e 2 mL di DMEM in sequenza per calibrare la pressione osmotica in condizioni sterili. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto. Coltivare le cellule nell'incubatore umidificato in condizioni di coltura cellulare standard per 24 ore o fino a quando le cellule raggiungono la confluenza dal 50% all'80%.
Dopo 24 ore di risciacquo, le cellule nella piastra del pozzo con PBS usando una pipetta per rimuovere le cellule morte galleggianti. Posizionare i campioni disinfettati o sterilizzati direttamente sulle cellule aderenti. Aggiungere 3 ml di materiale fresco in ogni pozzetto.
Coltivare le cellule in condizioni di coltura cellulare standard per altre 24 ore. Il diagramma schematico in questa figura mostra le fasi del metodo di coltura dell'esposizione. I passaggi iniziali per la preparazione cellulare sono gli stessi della coltura a esposizione diretta.
Successivamente, posizionare i campioni negli inserti del pozzo con una dimensione dei pori della membrana di 0,4 micrometri e posizionare gli inserti del pozzo con i campioni in ciascun pozzetto con le cellule. Coltivare le cellule in condizioni di coltura cellulare standard per altre 24 ore. Caratterizzazione post-colturale delle cellule.
Per la coltura diretta e la coltura ad esposizione diretta, fissare, macchiare, visualizzare e analizzare le cellule aderenti sia su piastre di pozzo che su campioni. Per la coltura di esposizione, analizzare le cellule aderenti alle piastre del pozzo. Raccogliere i terreni di post coltura da ciascun pozzo in un corrispondente tubo conico da 15 ml per ulteriori analisi.
Raccogliere tutti i campioni dopo la coltura per ulteriori analisi. Risciacquare le cellule aderenti su entrambi i campioni e le piastre del pozzo tre volte usando PBS. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% in ogni piastra del pozzetto.
Rimettere il coperchio sulla piastra del pozzo e lasciare che il PFA reagisca per 20 minuti. Dopo 20 minuti, aspirare il PFA ed erogarlo in una bottiglia di scarto. Risciacquare la piastra del pozzo tre volte usando PBS per rimuovere il PFA e trasferire i rifiuti nella bottiglia di scarico.
Preparare le scorte di lavoro degli agenti coloranti Seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere da 200 a 400 microlitri di agente colorante Alexa Fluor 488 Phalloidin diluito a ciascun pozzetto per coprire le cellule sulla piastra del pozzo e sul campione. Avvolgere la piastra del pozzo in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce e consentire ad Alexa Fluor 488 Phalloidin di reagire per 20 minuti a temperatura ambiente.
Raccogliere l'agente colorante Alexa Fluor 488 Phalloidin e dispensarlo nella bottiglia di scarico corrispondente. Risciacquare le piastre a parete tre volte utilizzando PBS per rimuovere l'eccesso di Alexa Fluor 488 Phalloidin ed erogare il PBS utilizzato nella bottiglia di scarico corrispondente. Aggiungere da 200 a 400 microlitri di DAPI diluito a ciascun pozzetto per coprire le cellule nel pozzo e sul campione.
Avvolgere la piastra del pozzetto in un foglio di alluminio e lasciare che il DAPI reagisca per cinque minuti a temperatura ambiente. Risciacquare la piastra del pozzo tre volte utilizzando PBS ed erogare il PBS usato nella bottiglia di scarico corrispondente. Dopo la colorazione, visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Quando possibile, scatta immagini a contrasto di fase delle cellule oltre alle immagini a fluorescenza. Immagine delle cellule sui campioni biodegradabili il prima possibile o immediatamente dopo la colorazione per evitare o ridurre possibili cambiamenti causati dalla continua degradazione dei campioni. Per la coltura diretta e la coltura ad esposizione diretta, visualizzare e valutare due tipi di cellule.
Uno, le cellule sui campioni a diretto contatto con i campioni, e due, le cellule hanno aderito sulla piastra del pozzo che circonda i campioni a diretto contatto con i campioni come mostrato nella figura. Per la coltura dell'esposizione, come mostrato qui, utilizzare la guida all'immagine quando si prendono le immagini di fluorescenza delle cellule per determinare se la risposta della cellula sarebbe diversa in risposta al gradiente di degradazione dinamica dei campioni. Immagine e analizza le celle situate nell'area all'interno dell'anello interno, a 3,5 mm di distanza dal centro, e l'anello esterno, che dista 7 mm dal centro separatamente.
Per ogni campione, e mentre si trovano nelle piastre di coltura, prelevare in modo casuale almeno cinque immagini da ciascuna area di interesse in cui le cellule sono a contatto indiretto o indiretto con i campioni a una distanza predefinita. Da tutte le immagini cellulari ottenute dal passaggio 4.3, quantificare la morfologia cellulare misurando l'area di diffusione cellulare e le proporzioni per l'analisi delle immagini. Contare il numero di celle in ogni area dell'immagine.
Calcolare la densità di adesione cellulare in condizioni di contatto diretto e indiretto come il numero di celle per unità di area. Analisi post-culturali di media e campioni. Prima dell'auto-fissazione, raccogli i media della postcultura.
Misurare i valori di pH dei mezzi di postcoltura in ciascun pozzetto immediatamente dopo la raccolta utilizzando un pHmetro precalibrato. Seguendo la fase precedente della misurazione del pH, raccogliere e diluire il mezzo utilizzando un fattore di diluizione desiderabile per misurazioni ottimali delle concentrazioni di ioni. Misurare le concentrazioni degli ioni di interesse nei mezzi di post coltura utilizzando uno spettrometro ad emissione ottica plasma-ottica accoppiato induttivamente abbreviato in ICP-OES.
Dopo lo studio cellulare in vitro, i campioni biodegradabili possono cambiare in dimensioni, massa, morfologia superficiale, microstruttura e composizione. L'analisi post-coltura dei campioni aiuta a comprendere il meccanismo di degradazione dei campioni. Dopo la coltura cellulare, scatta le fotografie dei campioni per mostrare possibili cambiamenti nelle dimensioni del campione, nel colore, nella morfologia e in altre caratteristiche visibili.
Asciugare o disidratare i campioni di post-coltura e misurare la massa, la dimensione e il volume del campione per quantificare eventuali cambiamenti di massa, dimensione e volume. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione per caratterizzare la microstruttura e la morfologia dei campioni. Utilizzare la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia e la defrazione a raggi X per caratterizzare la composizione e la fase dei prodotti di degradazione sui campioni.
Utilizzare FTIR o ATR per rilevare il legame chimico sulle superfici del campione. Risultati rappresentativi. Qui, la figura mostra le immagini rappresentative di fluorescenza di cellule staminali derivate dal midollo osseo in condizioni di contatto diretto e indiretto utilizzando diversi metodi di coltura.
Questa figura mostra i dati di esempio per la densità di adesione cellulare quantificata. Come mostrato nella figura A, nella coltura di esposizione diretta di 24 ore, le BMSC a diretto contatto con lo ZC21 hanno una densità di adesione cellulare significativamente maggiore rispetto a qualsiasi altro gruppo. Come mostrato nella figura B, nella condizione di contatto indiretto della coltura ad esposizione diretta, la densità di adesione BMSC è significativamente più alta per il gruppo ZC21 rispetto al gruppo magnesio.
Tuttavia, non mostra alcuna differenza significativa rispetto al T64 e ai gruppi di controllo solo delle cellule. Qui, la figura A mostra il valore del pH dei media post-cultura dopo la cultura dell'esposizione diretta e la cultura diretta. Per la coltura a esposizione diretta, i valori di pH dei fluidi vanno da 8,3 a 8,4 per tutti i campioni.
Nella coltura diretta, i valori di pH dei media vanno da 7,9 a 8 tra i gruppi. La figura B mostra la concentrazione di ioni magnesio nei mezzi di post-coltura. Sia nella coltura ad esposizione diretta che nella coltura diretta, le loro concentrazioni di ioni di magnesio nei gruppi ZC21 e magnesio sono significativamente più alte di qualsiasi altro gruppo di controllo.
Questa figura mostra i modelli XRD per ZSr41 e magnesio puro dopo una coltura di esposizione di tre giorni. Sono state osservate le fasi cristalline di diverse composizioni, come magnesio, ossido di zinco e idrossiapatite. Qui, la figura A mostra la sovrapposizione di immagini SEM e mappe EDX della composizione elementare superficiale per il magnesio rivestito di ossido di magnesio e il controllo dei substrati di magnesio e del vetro dopo 24 ore di coltura diretta con BMSC.
La figura B mostra la composizione elementare quantitativa della superficie delle superfici campione, indicando diverse deposizioni formate durante la coltura cellulare. Conclusioni. In questo video, abbiamo introdotto tre diversi metodi in vitro per valutare la citocompatibilità dei materiali implantari biodegradabili sulla base di diversi progetti sperimentali e applicazioni previste. Le interazioni tra materiali e vari tipi di cellule potrebbero essere studiate attraverso il metodo di coltura diretta, il metodo di coltura di esposizione diretta e il metodo di coltura di esposizione.
Questo video ha presentato i principali metodi in vitro per studiare l'effetto dei materiali biodegradabili insieme ai loro prodotti di degradazione sui comportamenti cellulari per una varietà di applicazioni implantari mediche.
