プロトコルは、放射性同位元素の使用を回避し、多くの労働者がグリコーゲン代謝の酵素を研究することを妨げる可能性のある障壁を取り除くため、重要です。記載された手順は安価であり、単純な分光光度計へのアクセスのみを必要とする。グリコーゲンシンターゼ活性の測定から始めるには、UDPグルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびNDPキナーゼの予め調製したストック溶液を氷上で解凍する。
水浴を摂氏30度に予熱します。ストック溶液の準備ができたら、テキストプロトコルに記載されているように、試薬を15ミリリットルのチューブに追加することにより、グリコーゲンシンターゼアッセイの数に応じて十分なアッセイ混合物を調製します。反応混合物のNADHを水で置換してブランク反応を調製し、反応物を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
ブランク反応を使用して、分光光度計の波長を340ナノメートルに設定します。1.5ミリリットルのチューブに反応混合物の770マイクロリットルのアリコートを1つ取り、NDPキナーゼとピルビン酸キナーゼ乳酸デヒドロゲナーゼ混合物をそれぞれ2マイクロリットルずつチューブに順次加えます。混合後、チューブを水浴中で摂氏30度で3分間静かにインキュベートし、反応混合物を予熱する。
次に、グリコーゲンシンターゼを含むサンプル30マイクロリットルをpH 7.8の20ミリモルトリスバッファーに加え、穏やかに混合してから、反応混合物を廃棄メタクリレートキュベットに移します。キュベットを分光光度計に入れ、340ナノメートルの吸光度を10〜20分間、時間間隔で記録します。次に、得られた吸光度を時間に対してプロットする。
放出されたグルコースを測定するには、加熱されたグリコーゲンサンプルから使い捨てメタクリレートキュベットに40マイクロリットルの上清を移します。そして、原稿に記載されているように、測定量のトリエタノールアミン、塩酸硫酸マグネシウム緩衝液、NADP ATP混合物および水を加える。気泡を発生させずに穏やかに上下にピペッティングして混合物を混合します。
各キュベットに0.5マイクロリットルのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを加える。ピペッティングで混合した後、混合物を室温で10分間インキュベートし、340ナノメートルの吸光度を記録します。次に、前述のように各キュベットに0.5マイクロリットルのヘキソキナーゼを混合し、15分間インキュベートしてから、340ナノメートルの吸収セットを記録する。
その後、室温で5分間インキュベーションを続け、吸光度を記録した。吸収が15分で記録されたものから増加した場合は、340ナノメートルで最終的な吸収を記録する前に5分間インキュベーションを続けます。グリコーゲン分岐を決定するには、650マイクロリットルのヨウ素塩化カルシウムカラー試薬ストックを1.5ミリリットルのチューブ内の100マイクロリットルの水と組み合わせ、溶液を完全に混合してから使い捨てメタクリレートキュベットに移します。
キュベットを分光光度計に入れて、330〜800ナノメートルのバックグラウンドスペクトルを収集する波長スキャンモードで実行を行います。別の1.5ミリリットルのチューブに、650マイクロリットルの作業用ヨウ素塩化カルシウムカラー試薬と50マイクログラムのカキグリコーゲンを混ぜ合わせ、水で最終容量を750マイクロリットルに構成します。混合物を完全にブレンドした後、溶液を使い捨てメタクリレートキュベットに移し、330〜800ナノメートルの吸収スペクトルを収集します。
同様に、前述のように50マイクログラムのアミロペクチンおよび30マイクログラムのアミロースで吸収スペクトルを得る。特性評価されていないグリコーゲンサンプルの分岐構造の指標を得るには、25〜50マイクログラムのグリコーゲンと650マイクロリットルの作業ヨウ素塩化カルシウム呈色試薬を組み合わせ、前述のように進めて吸収スペクトルを取得します。グリコーゲン合成酵素アッセイでは、経時的に340ナノメートルでの吸収の直線的な減少が観察された。
アッセイにグリコーゲンシンターゼを添加しすぎると、反応は最初の2分以内に完了しました。グリコーゲンシンターゼを含まない対照反応は、吸光度の測定可能な減少を示さなかった。精製酵素を用いたグリコーゲンホスホリラーゼアッセイからのデータは、3分間持続する線状相を有していた。
毎分約0.01〜0.04単位の吸光度増加速度が最適です。グリコーゲン脱分岐酵素アッセイにおいて、反応は少なくとも10分間持続する線状相を示した。グリコーゲン分岐酵素アッセイの代表的なデータは、分岐酵素を含まない対照サンプルと分岐酵素を含む反応との間の吸光度の差を示した。
アッセイの狭いダイナミックレンジが例示される。生成できる吸光度の最大変化は0.4吸光度単位であり、吸収の変化が約0.2吸光度単位である場合、直線性は失われます。グリコーゲン分岐評価に使用されたグリコーゲン、アミロペクチン、およびアミロースの質量は、それぞれ異なる吸光度の最大値で、約0.7〜0.8の最大吸光度測定値を示しました。
グリコーゲンサンプルは、約400ナノメートルと460ナノメートルに2つのピークを生成しました。ヨウ素塩化カルシウム発色試薬は非常に濃いです。吸収スペクトルを収集する前に、グリコーゲンサンプルが試薬と完全に混合されていることを確認することが重要です。
